精神分裂症生物标记物、筛选方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及精神分裂症生物标记物、筛选方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 精神分裂症（schizophrenia, SZ)是最为严重的精神障碍之一，以幻觉、妄想、精 神运动性兴奋等阳性症状和（或）以情感迟钝、情感淡漠、社交退缩、意志减退等阴性症状 为主要临床特征，其对患者的认知、情感、行为和社会功能造成严重损害。
[0003] 目前，虽对SZ的病因已有一定的认识，如研宄者依据神经影像学、基因组学、蛋白 组学、免疫组化等技术对SZ病因学研宄的结果涉及遗传因素、社会心理因素、神经生化病 理学说及大脑病理和脑结构变化学说等。但对其病理过程尚缺乏充分的了解，这阻碍了对 SZ诊断、治疗、康复技术的进步。大量研宄显示，遗传因素在SZ发生、预后、疗效、复发中起 主要作用，从SZ的家族聚集性，患者同胞再患的危险度以及同卵、异卵双生共患的差异推 断，遗传因素占 SZ发病因素的65%~85%。因此，对SZ遗传机制及其调控过程的了解，对 揭示其病理过程具有重要意义，对SZ的诊断和治疗也具有较好的前景。
[0004] 已有研宄表明，精神分裂症病人若能早期明确诊断并及时得到有效治疗，可以显 著改善患者的心理、生理、社会功能以及工作效率，并大大减少治疗费用。然而，目前对精神 分裂症的诊断仍是依靠其临床症状的主观评估，缺乏有效的客观诊断"金标准"，因而在临 床上误诊、误治时有发生。另一方面，由于事先未知患者对哪种药物敏感，临床上不得不用 "试错法"给药，这不仅影响患者的治疗效果，而且降低其服药依从性，并造成巨大的医疗资 源浪费。因此，有必要研发一种具有敏感性和特异性的生物标志物，来提高精神分裂症的诊 断科学性，并对其亚型加以区分，以便于有针对性地进行药物干预和开展临床科学研宄。
[0005] miRNA是一种小分子的非编码RNA，长度为大约为22个碱基。miRNA的生成包括两 步剪切：首先细胞核内的miRNA基因转录成pri-miRNA，由细胞核内的酶DroshaRNase将其 剪切成miRNA前体pre-miRNA。核内的转运蛋白将pre-miRNA转运到细胞质中，然后在细 胞质中的另一种酶Dicer把miRNA前体剪切成双链miRNA，通过部分或完全地与靶mRNA的 3'非翻译区（3'UTR)互补配对，阻止其翻译或使其降解，从而起到基因转录后调节的作用。 约有50%的蛋白质编码基因受到miRNA的精确调控，多个miRNA分子可以共同调节一个基 因的表达，一个miRNA分子亦可调控数百、上千个基因的表达。越来越多的研宄证明，在大 脑的发育、神经发生、神经元成熟及突触形成过程中，miRNA起关键的调控作用。进一步的 研宄表明，精神分裂症的发生、发展中，miRNA亦起重要作用，并与抗精神病药物的疗效有相 关性。因此，某些MicroRNA可成为精神分裂症诊断和预测抗精神分裂症药物治疗效果的生 物标记物。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是：提供精神分裂症生物标记物、筛选方法及试剂盒。
[0007] 在本发明的第一方面，提供了精神分裂症诊断生物标记物，所述标记物包括 miRNA-1273d、miRNA-1303、miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、 miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096。
[0008] 在本发明的第二方面，提供了上述精神分裂症诊断生物标记物的筛选方法，包括 以下步骤：分别选取等量的精神分裂症患者和健康对照组数名，取血样，从中提取总RNA， 提取得到的总RNA经过Ploly A加尾，再进一步用生物素标记，标记好的RNA与RNA芯片杂 交并通过RNA芯片筛查出差异性表达的miRNA ;选取若干例精神分裂症患者，设为病例组； 选取若干例健康对照者，设为对照组；分别采集血样，提取出外周血单核细胞中的总RNA 后进行miRNA的反转录和荧光定量PCR检测，所得数据使用统计学方法进行分析，对通过 RNA芯片筛查得到的差异性表达miRNA进行验证，得到在病例组和对照组间呈显著差异的 miRNA种类。
[0009] 在本发明的第三方面，提供了 一种精神分裂症诊断试剂盒，其能够测定血液 中 miRNA-1273d、miRNA-1303、miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、 miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096 的含量。
[0010] 优选的，所述精神分裂症诊断试剂盒含有miRNA-1273d、miRNA-1303、 miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096 的引 物探针，所述探针序列如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0011] 所述试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0012] 在本发明的第四方面，还提供了序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示的探针的用 途，其用于制备精神分裂症诊断试剂盒。
[0013] 在本发明的第五方面，提供了一种预测精神分裂症疗效的生物标记物，所述标记 物包括 miRNA-21-3p 和 miRNA-3916。
[0014] 在本发明的第六方面，提供了上述预测抗精神分裂症药物疗效的生物标记物的筛 选方法，包括以下步骤：选取若干例精神分裂症患者进行临床药物干预随访观察，对选取的 患者分别施以临床常用的抗精神分裂症药物，在用药前后分别采集血样，提取出外周血单 核细胞中的总RNA后进行miRNA的反转录和荧光定量PCR检测，所得数据使用统计学方法 进行分析，得到用药前后表达水平有显著性差异的miRNA。
[0015] 在本发明的第七方面，提供了一种预测抗精神分裂症药物疗效的生物标记物检测 试剂盒，其能够测定血液中miRNA-21-3p和miRNA-3916的含量。
[0016] 优选的，所述预测抗精神分裂症药物疗效的生物标记物检测试剂盒含有 miRNA-21-3p和miRNA-3916的引物探针，所述探针序列如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所 不O
[0017] 所述试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0018] 在本发明的第八方面，还提供了序列如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的探针 的用途，其用于制备预测抗精神分裂症药物疗效的试剂盒。
[0019] 在本发明的第九方面，提供了鉴别精神分裂症与广泛性焦虑症、抑郁症、精神发育 迟滞的试剂盒，所述试剂盒含有miRNA-26b的引物探针，所述探针序列如SEQ ID NO. 11所 不O
[0020] 在本发明的第十方面，还提供了序列如SEQ ID NO. 11所示的探针的用途，其用于 制备鉴别精神分裂症与广泛性焦虑症、抑郁症、精神发育迟滞的试剂盒。
[0021] 所述试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 1、精神分裂症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过microRNA表达水平 这种客观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；
[0024] 2、有望通过miRNA模拟物和拮抗物（修饰寡核苷酸）改变特定miRNA表达水平能 够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗精神分裂症；
[0025] 3、有望通过检测特定miRNA表达水平对抗精神分裂症药物的疗效进行预测；4、有 望通过检测特定miRNA表达水平对精神分裂症患者转归及