钾离子转运蛋白基因trkH、其编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及来源于海洋微生物的钾离子转运蛋白基 因 trkH、其编码蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] K+是植物及微生物生长所必需的营养元素之一，广泛分布于有机体内，参与多种 重要的生理过程。我国土壤普遍缺钾，并伴有一定程度盐渍化，细胞内过多的Na +积累会 产生毒性，因此维持细胞质内相对稳定且较高K+含量和较低Na+含量至关重要 [1]。一些研 宄已从不同植物中克隆得到一些钾离子吸收转运相关基因，而这些基因大部分来自甜土植 物，表达的蛋白多数对Na +敏感，使得它们在高Na +环境下无法较好地行使K +吸收功能。已 有文献报道，某些微生物中的K+转运蛋白在Na +存在下仍有较高K +吸收活性，这与它们的 嗜盐或耐盐属性有关[2]。海洋是高盐环境，海洋微生物中的K+转运蛋白很可能具有Na +不 敏感性。由于海洋环境微生物中99%是未可培养的[3]，为了获得功能基因，选用海洋微生 物宏基因组DNA为实验材料，该宏基因组DNA包含所收集海水中几乎所有微生物的遗传信 息。通过克隆手段得到目的基因后，将基因以无缝连接技术构建到酵母表达载体中，并用电 击转化法将重组质粒导入K +吸收缺陷型酿酒酵母CY162中进行功能互补实验，这也是首次 细菌来源的trk基因在真核系统内的表达探宄。
[0003] 参考文献：
[0004] [1JVOLKOV V1WANG BjDOMINY PJ, et al.A salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana, possesses effective mechanisms to discriminate between potassium and sodium[J]. Plant, Cell&Environment, 2004, 27(I):1-14.
[0005] [2]FAILLIE C. C, JABN0UNE M, ZIMMERMANN S, et al. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family[J]· Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67(15):2511-2532.
[0006] [3] Joshi G K1Jugran J1Bhatt J P. Metagenomics: The Exploration of Unculturable Microbial World[M]. Advances in Biotechnology.Springer India, 2014:105-115.
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种来源于海洋细菌且具有钾吸收 功能的钾离子转运蛋白基因，该基因是从海洋微生物宏基因组DNA中分离的一个DNA分子， 命名为trkH。
[0008] 本发明提供的来源于海洋微生物的钾离子转运蛋白基因 trkH，具有如SEQ ID NO: 1所示的碱基序列。其序列由1392个碱基组成，自5'端第1到第1392位残基为该基因 的开放阅读框序列。
[0009] 本发明的另一方面在于提供具有与上文所述的SEQ ID NO: 1所示的碱基序列95% 以上的同源性，且编码与SEQ ID NO: 1所示的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能 蛋白质的喊基序列。
[0010] 本发明的另一方面在于提供上文所述的钾离子转运蛋白基因 TrkH编码的蛋白 质，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，其是有463个氨基酸残基组成的蛋白质。
[0011] 本发明的另一方面在于提供上文所述的钾离子转运蛋白基因 TrkH编码的蛋白质 的衍生蛋白质，其具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、 缺失或添加而产生的氨基酸序列，且该衍生蛋白质与上文所述钾离子转运蛋白基因 trkH 编码的蛋白质具有相同的生物学功能。
[0012] 本发明的另一方面在于提供含有上文所述基因的重组表达载体。本发明所提供的 来源于海洋微生物的钾离子转运蛋白基因 trkH，连接于可以诱导外源基因表达的表达载体 制备得到trkH基因重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒pYES 2.0。酵母表 达载体pYES2. 0是带有Amp和Ura筛选标记的穿梭质粒，在原核生物如大肠杆菌中，该载体 可以利用T7启动子启动下游基因的表达；在真核微生物如酿酒酵母中，该载体则可以利用 被半乳糖高诱导的GAL启动子启动下游基因的表达。在大肠杆菌内，载体pYES2.0由于具 有Amp抗性所以可进行氨苄霉素筛选，而在真核微生物酿酒酵母CY162中，氨苄霉素对其生 长不会造成影响，因此在酵母中无法用该方法筛选。酿酒酵母CY162的基因型显示，其Ura 基因突变，尿嘧啶合成功能受到阻碍，因此不能在缺少Ura的培养基中生长，可据此进行有 效筛选。
[0013] 本发明的另一方面在于提供含有上文所述trkH基因的宿主细胞。优选地，该宿主 细胞含有trkH基因的重组表达载体。在本发明的技术方案中，所述的宿主细胞优选采用 酿酒酵母 K+吸收缺陷型菌株 CY162 (Mat a，ura3-52, his3D200, his44-15, trkDl, trkD2: : p cK64)。通过功能互补、离子耗竭和生长情况比较等实验证实该基因在提高转基因酵母在低 钾和盐胁迫环境下K +吸收中的应用。实验结果表明，本发明所述转基因微生物提高了 K +吸 收速率和对Na+的不敏感性。
[0014] 本发明的另一方面在于提供上文所述基因在培育低钾且盐胁迫环境下仍能良好 生长的农作物中的应用。本发明的trkH基因所编码的TrkH蛋白具有K +吸收和对Na+不 敏感的特性，该基因虽然来自细菌但本发明成功得到该基因的转基因真核微生物（酿酒酵 母），并证明转基因微生物在低钾和高盐（Na+)浓度下的K +吸收功能，说明本发明的基因可 以转入至植物细胞等真核细胞中，并应用于在低钾且盐胁迫环境下仍能良好生长的农作物 的培育。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明的基因 trkH来源于海洋细菌，其编码的蛋白TrkH具有吸收转运钾离子的 功能，能提高转基因 K+吸收缺陷型酿酒酵母的K +吸收效率和对Na +的不敏感性，从而提高 其在缺钾且盐胁迫条件下的生长状况。这是该类基因首次在真核系统中鉴定到相关蛋白功 能，培育相应转基因植物，将在农作物钾高效利用方面具有很高的应用价值，同时能够很好 的应用于缺钾高盐环境中优良性状农作物的培育。
【附图说明】
[0017] 图1为trkH基因的克隆与分析中进行的电泳图，其中：图IA为海洋微生物宏基 因组DNA，其中泳道M为λ -EcoTHDNA Marker，泳道1和泳道2为宏基因组DNA ;图IB为 PCR扩增的trkH基因的部分片段电泳图，其中泳道M为DNA marker DL 2000,泳道1为扩 增的trkH基因的部分片段；图IC为锚定PCR扩增的trkH基因5'端片段连pMD18-T克隆 载体后PCR检测电泳图，其中泳道M为DNA marker DL 2000,泳道1-5为含有5'端序列的 质粒，泳道6为空白对照；图ID为锚定PCR扩增的trkH基因3'端片段连pMD18-T克隆载 体后PC