检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物及相应检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物及相应试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪 发生呼吸道疾病，生产性能降低，死亡率升高的一种传染性猪病。
[0003] 尽管目前国内外对PRRSV的病原学、血清分型、诊断做了大量的研宄，但对全世界 猪及相关产品的威胁众所周知，它造成的经济损失每年至少为上百亿美元。尤其与其它繁 殖与呼吸综合征在临床上很难区分，同时在临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、 病程长短及感染毒株毒力等不同而有所差别，可能缺乏特征病症，这给猪繁殖与呼吸综合 征的诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难以定性。
[0004] 快速简单的实验室诊断方法是确诊猪繁殖与呼吸综合征唯一有效地途径。为了确 定猪繁殖与呼吸综合征是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还 必须通过病原学检测以确诊病原的存在，一般检测方法为生物学实验、血清型诊断技术和 分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率 较低，检测周期太长，并且这些技术普遍费用太高。随着2006年第一例欧洲型猪繁殖与呼 吸综合征在我国检出，建立一种快速诊断并且能够区别欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综 合征病毒（PRRSV)的多重RT-LAMP试剂盒，完成对PRRS的快速诊断以及对其进行严格监控 具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物及相应试剂盒。 通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术（LAMP)扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病 毒基因组上的特定区域，通过检测特定产物的形成与否，从分子水平对血液中的欧洲型猪 繁殖与呼吸综合征病毒核酸进行筛查。
[0006] 本发明提供检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物，所述特异性引物 包括外侧引物和内侧引物； 所述外侧引物的序列如下： 上游引物为：5'_ GCTGAATGGGACCGAATCG-3'， 下游引物为：5' -ATACGAGCGCTGCGAAAG-3' ； 所述内侧引物的序列为： 上游引物为：5'_ GGATATGAGTGGCAACCGGGirnTTTGTCCAGCCAITTTGACTGG -3'， 下游引物为：5'_ TCTCGGCGCTGTGTCCACTATTTTTCGTACACGCTGCTGAGTAC -3'。
[0007] 本发明的第二个目的是提供欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测试剂盒，所述 试剂盒中包含权利要求1所述的特异性引物。
[0008] 本发明的第三个目的是提供欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测试剂盒的使 用方法，提取待检物RNA，使用权利要求1所述的特异性引物，采用LAMP方法扩增，对扩增产 物进行分析。
[0009] 作为优选的方案，所述LAMP方法扩增的反应程序为：64°C 60min，然后80°C 5 min〇
[0010] 本发明的第四个目的是提供欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，是提取 待检物RNA，使用权利要求1所述的特异性引物，采用LAMP方法扩增，对扩增产物进行分析： 反应后的产物肉眼可见底部浑浊；或将反应后的产物电泳，染色后，观察是否有条带出现； 肉眼可见底部浑浊或有条带出现则为检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0011] 作为优选的方案，所述LAMP方法扩增的反应程序为：64°C 60min，然后80°C 5 min〇
[0012] 本发明的第五个目的是提供本发明所述的特异性引物在检测欧洲型猪繁殖与呼 吸综合征病毒中的应用。
[0013] 本发明从待检动物的血液或病死动物的组织中提取其全基因组RNA，以RNA为模 板，以特异性的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征的引物进行多重RT-LAMP，对得到的产物进行电 泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0014] 本发明较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法特异性和敏感性高，试验 快捷，仅需1小时即可以完成实验；试验成本极低。本发明可以相当方便地一次性鉴定欧洲 型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染，可以及时快捷的对疫病情况及区域、环境做出及时快 捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积 极的意义。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征的LAMP和PCR检测方法的敏感性比较图。A图， RT-LAMP检测结果。从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-100 ;1-8泳道：2ng、lng、0. 5ng、 0. 25ng、0. 125ng、0. 0625ng、0. 0313ng 和 0. 0156ng ;B 图，RT-PCR 检测结果。从左至右依次 为：Ml，DNA 分子量标准 DL-2000 ;1-8 泳道：2ng、lng、0.5ng、0.25ng、0. 125ng、0.0625ng 和 0· 0313ng ; 图2为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征的LAMP与其余病毒的交叉性检测电泳结果。从左 至右依次为：从左至右依次为泳道，DNA分子量标准DL-2000 ;2泳道，欧洲型猪繁殖与呼 吸综合征病毒的RNA ;3泳道，猪细小病毒的RNA ;4泳道，猪圆环-2型病毒的RNA ;5泳道， 美洲型PRRSV对照，6泳道，阴性对照血清RNA。
【具体实施方式】
[0016] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0017] 实施例1本发明的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征检测试剂盒的使用方法 1欧洲型猪繁殖与呼吸综合征的核酸提取 采集待检动物的血液或病死动物的组织，按照宝生物工程（大连）有限公司提供的 MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒提取全病毒RNA。
[0018] 2欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的LAMP反应 参照Genbank登录的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的0RF-5基因的序列，本申请人 设计并合成两对引物。
[0019] 外侧引物序列如下： 上游为 F3:5' - GCTGAATGGGACCGAATCG-3' ； 下游为 B3: 5' -ATACGAGCGCTGCGAAAG-3'。
[0020] 内侧引物： FIP:5'_ GGATATGAGTGGCAACCGGGTTTTTTTGTCCAGCCATTTTGACTGG -3'； BIP:5'_ TCTCGGCGCTGTGTCCACTATTTTTCGTACACGCTGCTGAGTAC -3'。
[0021] 以提取的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RNA为模板，在50 μ L反应体系中 加入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA 1 μ L，10 μ mol/L的外侧上下游引物各1 μ L， lymol/L的内侧上下游引物各lyL，2. 5mmol/L的dNTP 2yL，Bst DNA聚合酶8U，10X缓 冲液5以1^，加(1(1!120至终体积为5(^匕1^1^反