纤维二糖水解酶的变体的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请序列No. 61/736, 327的 优先权权益，并且以引用的方式全文并入本文中。
技术领域
[0003] 本公开总体上涉及糖苷水解酶变体，特别是纤维二糖水解酶（CBH)的变体。还描 述了编码CBH变体的核酸、包含CBH变体的组合物、产生CBH变体的方法以及使用所述变体 的方法。
[0004] 政府权利
[0005] 本发明是在由美国能源部授予的基金号DE-FC36-08G018078下、在政府支持下进 行的。政府具有本发明的某些权利。
[0006] 发明背景
[0007] 纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多会产 生能够将聚合物底物水解成单体糖的胞外酶的微生物（包括细菌、酵母和真菌）降解并且 用作能源（Aro等人，2001)。由于对非可再生资源途径的限制，所以纤维素成为主要可再生 能源的潜能是巨大的（Krishna等人，2001)。通过生物过程对纤维素的有效利用是克服食 品、饲料和燃料短缺的一种途径（Ohmiya等人，1997)。
[0008] 纤维素酶是水解纤维素（0-1，4-葡聚糖或0D-糖苷键）导致形成葡萄糖、纤 维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类型：内切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（EC3. 2. 1. 91) ( "CBH"）和0 -葡萄糖 苷酶（[0]-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC3. 2. 1.21) ("BG")。（Knowles等人，1987 ;Shulein， 1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结 晶纤维素（Nevalainen和Penttila，1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存 在是结晶纤维素有效溶解所必需的（Suurnakki等人，2000)。葡萄糖苷酶起到从纤维二 糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单位的作用（Freer，1993)。
[0009] 已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌会产生能够降解结晶形式 的纤维素的整个纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。由于许多酵母诸如 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌起特殊作 用。（参见例如Aro等人，2001;Aubert等人，1988;Wood等人，1988 ;和Coughlan等人）。
[0010]CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可进一步扩展以包括每个分类内的多个组分。 例如，已从包括里氏木霉（Trichodermareesei)的多个真菌来源分离了多种CBH、EG和BG， 里氏木霉含有2种CBH的已知基因，g卩，CBHI和CBHII、至少8种EG的已知基因，g卩，EG 1、￡6 11、￡6 111、￡61￥、￡6￥、￡6￥1、￡6￥11和￡6￥111以及至少5种86的已知基因，即，861、 BG2、BG3、BG4 和BG5。
[0011] 为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG每个分类 的组分的整个纤维素酶体系，而分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效（Filho等人， 1996)。已观察到来自不同分类的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素 酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以有效地降解纤维素。（参见例如Wood，1985)。
[0012] 在本领域中已知的是，纤维素酶可用于处理纺织品，用于增强洗涤剂组合物的清 洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等（Kumar等人，1997)。
[0013] 已描述了具有改善的清洁性能（美国专利No. 4, 435, 307 ;英国申请No. 2, 095, 275 和2, 094, 826)并且用于处理织物以改善纺织品的触感和外观的含有纤维素酶的洗涤剂组 合物（美国专利No. 5, 648, 263、5, 691，178 和 5, 776, 757 ;英国申请No. 1，358, 599 ;静岡県 立纺织品工业研宄所报告（TheShizuokaPrefecturalHammamatsuTextileIndustrial ResearchInstituteReport),第 24 卷，第 54-61 页，1986)。
[0014] 在本领域中进一步已知的是，纤维素酶可用于将纤维素原料转化成乙醇。这一过 程具有许多优点，包括否则将丢弃（例如焚烧或土地填埋原料）的大量原料的易于可利用 性。已考虑将主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的其他材料，例如木材、草本作物和农 业或城市废物用作乙醇产生的原料。
[0015] 本领域中有利地是提供纤维二糖水解酶（CBH)变体，其具有改善的用于将纤维素 材料转化成单糖、二糖和多糖的特性。变体CBH的改进的特性包括但不限于：改变的温度依 赖性活性概况、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。
【发明内容】
[0016] 本公开描述了具有纤维素酶活性的分离的纤维二糖水解酶（CBH)、编码此类CBH酶的核酸、含有CBH酶编码多核苷酸的宿主细胞（例如表达CBH酶的宿主细胞）、含有CBH 酶的组合物以及其产生和使用方法。
[0017] 因此，本发明的方面提供变体CBH酶，其相对于野生型CBH酶具有改善，其中对 于选自以下各项的一种或多种特性来说，所述变体得到显著改善：增大的解链温度（Tm)、 PASC水解测定性能、全水解产物PCS(whPCS)测定性能和稀氨玉米杆（daCS)测定性能。在 某些实施例中，CBH变体具有所述改善的特性中的至少两种、所述改善的特性中的至少三种 或所有所述改善的特性。
[0018] 本发明的方面提供如以下所述的亲本纤维二糖水解酶（CBH)的分离的变体，其中 任何所指示的CBH氨基酸位置均对应于SEQIDN0:3的氨基酸序列：
[0019] 1. 一种CBH变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQIDN0:3具有至少80 % 序列同一性，并且在全水解产物酸预处理的玉米杆（whPCS)测定和稀氨玉米杆（daCS)测定 中具有优于所述亲本CBH酶的显著改善的性能。
[0020] 2.根据1所述的CBH变体，其中所述变体包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自： F418M、T246S、T255V以及其任何组合。
[0021] 3.根据2所述的CBH变体，其中所述变体包含F418M置换。
[0022] 4.根据2或3所述的CBH变体，其中所述变体包含T246S置换。
[0023] 5.根据2、3或4所述的CBH变体，其中所述变体包含T255V置换。
[0024] 6.根据2至5中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所 述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：D241N、G234D、P194V、T255I、T255K、T255R以及其 组合。
[0025] 7.根据2至6中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所 述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：￥2470、了246￥、财9?、吧006以及其组合。
[0026] 8.根据2至7中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所 述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：了3561、1246?、12550、吧001?以及其组合。
[0027] 9.根据2至8中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所 述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：T255P、S92T、T41I以及其组合。
[0028] 10.根据3所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T246P置换。
[0029] 11.根据3所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T246V置换。
[0030] 12.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255V置换。
[0031] 13.根据3、4、10或11所述的0811变体，其中所述变体进一步包含12551置换。
[0032] 14.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255K置换。
[0033] 15.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255R置换。
[0034] 16.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T25?置换。
[0035] 17.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255P置换。
[0036] 18.根据3、4、5和10至17中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 D241N置换。
[0037] 19.根据3、4、5和10至18中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 G234D置换。
[0038] 20.根据3、4、5和10至19中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 P194V置换。
[0039] 21.根据3、4、5和10至20中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 N200G置换。
[0040] 22.根据3、4、5和10至20中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 N200R置换。
[0041] 23.根据3、4、5和10至22中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 N49P置换。
[0042] 24.根据3、4、5和10至23中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 Y247D置换。
[0043] 25.根据3、4、5和10至24中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含 T356L置换。
[0044] 26.根据3、4、5和10至25中任一项所述的CBH变体，其