丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及丙烯酸及脂类废料处理技术领域，具体涉及丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研宄方法。
【背景技术】
[0002]丙烯酸树脂是一种重要的化工原料，广泛应用于油漆、涂料、皮革、纺织、印刷等工业。目前，我国丙烯酸树脂的总产量约120万吨，按照每生产、I吨丙烯酸产生1.2吨废水计算，每年我国丙烯酸及其酷类废水总量在140万吨左右。丙烯酸废水组分复杂、污染物浓度高、降解难度大，环境危害性强，该类废水的有效治理对节能减排及可持续发展具有重要的意义。
[0003]当前，丙烯酸及其酷类废水的主要处理方法是焚烧法，具有技术成熟，占地面积小、处理效率高、可以回收焚烧过程中产生的热量等优点，但是焚烧法不可避免的存在处理费用较高、具有二次污染等问题，因此人们开发并研宄了一些新的方法。催化湿式氧化法处理丙烯酸树脂具有去除效率高、能耗低、二次污染小的优点，是较为清洁的处理技术。但是，存在运行成本高、控制难度大、重金属催化剂潜在的污染等问题；超临界水氧化法处理丙烯酸及其酷类废水具有反应时间短、污染物去除彻底、占地面积小、清洁环保等优势，但是高浓度溶解氧、高温高压带来的设备腐蚀和无机盐沉积是该技术面临的主要问题；纤维吸附法、离子交换纤维法；Fenton氧化法、光电子波分解法降解丙烯酸及其酷类废水。均具有反应条件温和、反应速度较快、去除效率较高的特点，但是由于目前深入研宄较少，且处理成本较高，尚未能应用到实际工程处理领域。利用生物法处理丙烯酸及其酷类废水具有能耗低、反应条件温和且效率较高，厌氧过程还可以回收沼气，更加符合国家节能减排、可持续发展的战略路线。研宄具有专属适应性微生物的筛选驯化培养，对于提高生物反应系统的耐受性和稳定性，提高降解效率具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研宄方法，它采用定时转接逐步提高碳源的方法，筛选出的菌株对高浓度丙烯酸废水具有较好的降解能力，为丙烯酸废水处理提供新的方法。
[0005]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明是采用以下技术方案:它的培育筛选及其降解性能研宄方法:
1.1菌种来源及培养基
菌种分离自某汽车喷涂车间排污口污泥
营养培养基:蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g, NaCl1.25 g、蒸馏水250 mL ；
固体营养培养基:蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75g、NaCl 1.25g、蒸馏水250mL、
琼脂5g ；
无机盐培养基:NaC10.5g、NH4NO30.4g、KHZPO4L 0g、KZHPO4L 0g、酵母浸粉 0.2g，微量元素液4mL，蒸馏水lOOOmL，调pH值为7.2 ；
微量元素液:MgS042.0g, CuSO40.5g，MnSO40.5 g, FeSO4.7H20 0.5g、
CaCl20.5g、蒸饱水 500mL ；
降解用无机盐培养基:NaCl 0.5g、NH4NO30.4g、KHZPO4L 0g、KZHPO4L 0g、酵母浸粉0.2g、微量元素液4mL、丙烯酸废水lOOOmL、调pH值为7.2 ；
1.2菌种培养
1.2.1丙烯酸高效降解菌的筛选(a)制备菌液:将汽车涂装废水排污口污泥加入无菌水中，汽车涂装废水排污口污泥的浓度为0.08g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5%，300C，30r/min条件下摇床避光培养7d，得到菌液。
[0006](b)制备丙烯酸树脂降解菌系:将葡萄糖加入制备的菌液中，按菌液体积的5%接种丙烯酸废水，摇床避光进行传代培养，得到丙烯酸树脂降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，丙烯酸废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5%，每次传代培养7d，传代培养妻五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖。
[0007](c)选丙烯酸树脂降解菌系:往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的丙烯酸树脂降解菌系培养液并涂布均匀，30°C培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的丙烯酸树脂降解菌系。
[0008]1.2.2菌株的保藏
将筛选出来的丙烯酸高效降解菌株接种于固体营养培养基中，长出菌落后，制备成浓度为0D_=1的菌液，并于4°C的冰箱中保存备用。由于微生物具有易突变的特点，因此对冰箱中保存的菌种每两个月转接一次，以减少菌株的突变性。
[0009]1.2.3生理生化指标测定
对菌株进行系列生理生化特性实验，参照《简明第8版伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定。并采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度值来表征细菌生长量。
[0010]1.2.4 16S rDNA 鉴定
利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA。用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物。
[0011]正向引物为7F:5’ -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，
反向引物为 1540R:5’ -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。
[0012]PCR 反应条件:94°C /4min、94°C /45sec,55°C /45 sec, 72 °C /lmin，循环 30 次；72°C /lOmin, 1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。高效降解菌株16S rDNA序列通过Blast程序与RDP IIm中核酸数据进行比对分析。
[0013]1.2.5菌株对丙烯酸树脂的降解能力的测定
将筛选得到的高效降解菌株接种到含丙烯酸树脂的无机盐培养基中培养7d变化设置3个平行及一个空白对照，培养结束后通过测定培养液COD的表征丙烯酸树脂的降解效率。
[0014]本发明的有益效果:它采用定时转接逐步提高碳源的方法筛选出的菌株对高浓度丙烯酸废水具有较好的降解能力，为丙烯酸废水处理提供新的方法。
【附图说明】
[0015]图1为R002菌株的生长曲线与菌液pH值的变化；
图2为不同温度下XR002菌株的生长和降解曲线；
图3为不同pH下XR002菌株的生长和降解曲线；
图4为不同浓度下XR002菌株的生长和降解曲线。
【具体实施方式】
[0016]本【具体实施方式】采用以下技术方案:它的培育筛选及其降解性能研宄方法:
1.1菌种来源及培养基
菌种分离自某汽车喷涂车间排污口污泥
营养培养基:蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g, NaCl1.25 g、蒸馏水250 mL ；
固体营养培养基:蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75g、NaCl 1.25g、蒸馏水250mL、
琼脂5g ；
无机盐培养基:NaC10.5g、NH4NO30.4g、KHZPO4L 0g、KZHPO4L 0g、酵母浸粉 0.2g，微量元素液4mL，蒸馏水1000mL，调pH值为7.2 ；
微量元素液:MgS042.0g, CuSO40.5g，MnSO40.5 g, FeSO4.7H20 0.5g、
CaCl20.5g、蒸饱水 500mL ；
降解用无机盐培养基:NaCl 0.5g、NH4NO30.4g、KHZPO4L 0g、KZHPO4L 0g、酵母浸粉0.2g、微量元素液4mL、丙烯酸废水lOOOmL、调pH值为7.2 ；
1.2菌种培养
1.2.1丙烯酸高效降解菌的筛选(a)制备菌液:将汽车涂装废水排污口污泥加入无菌水中，汽车涂装废水排污口污泥的浓度为0.08g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5%，300C，30r/min条件下摇床避光培养7d，得到菌液。
[0017](b)制备丙烯酸树脂降解菌系:将葡萄糖加入制备的菌液中，按菌液体积的5%接种丙烯酸废水，摇床避光进行传代培养，得到丙烯酸树脂降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，丙烯酸废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5%，每次传代培养7d，传代培养妻五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖。
[0018](c)选丙烯酸树脂降解菌系:往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的丙烯酸树脂降解菌系培养液并涂布均匀，30°C培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的丙烯酸树脂降解菌系。
[0019]1.2.2菌株的保藏
将筛选出来的丙烯酸高效降解菌株接种于固体营养培养基中，长出菌落后，制备成浓度为0D_=1的菌液，并于4°C的冰箱中保存备用。由于微生物具有易突变的特点，因此对冰箱中保存的菌种每两个月转接一次，以减少菌株的突变性。
[0020]1.2.3生理生化指标测定
对菌株进行系列生理生化特性实验，参照《简明第8版伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定。并采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度值来表征细菌生长量。
[0021]1.2.4 16S rDNA 鉴