一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞的分离和培养技术领域，具体是一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]用动物胚胎和新生心肌细胞来培养心肌细胞的方法已广泛研宄，然而，胚胎细胞与成人细胞不同，研宄发现在胚胎和新生儿心肌细胞中离子通道特性及分布和收缩蛋白亚型表达的变化不同于成人心肌细胞，二者之中的动作电位也相差甚远。急性分离的心肌细胞及胚胎心肌细胞的培养已被广泛应用30多年，为医学研宄及新药研发做出了重要贡献，但是随着近年来分子生物学技术，心脏生理学的不断发展及完善，急性分离的心肌细胞越来越不能满足目前的研宄要求。因此成年动物心肌细胞培养将成为越来越重要的技术，可以广泛应用心脏病动物模型，药物筛选及心律失常的机理研宄。
【发明内容】
[0003]为解决上述技术问题本发明提供一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，该方法使用方便且培养的心肌细胞成活率高并具有极好的稳定性。
[0004]本发明采用如下技术方案:一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，包括以下步骤:(1)急性细胞分离:(a)将成年豚鼠麻醉后快速取出心脏放置于4 C0含钙液中去除心包，找出主动脉然后挂于灌注装置上开始心脏逆向灌注，先用含钙液灌流2min，然后用无钙EGTA液灌流5min，再用酶解液循环灌流8_10min，再用酶洗脱液灌流5min ； (b)剪下心室肌组织放入无菌培养皿并切碎，(c)将切碎的心室肌组织加入酶洗脱液中，在37° C下用自动摇晃机进行机械性分离5-10min得到细胞悬浮液(d)将细胞悬浮液用200目的尼龙纱布过滤，所得滤液中的心室肌细胞准备下一步培养；其中，所述含钙液为:300ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+浓度为750 ymol/L ;所述无钙EGTA液为:300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA浓度为3.3 ymol/L ;所述酶解液为:80ml灌流母液中加入CaCl2、粗胶原酶和蛋白酶，使Ca2+浓度为100 μπιοΙ/L、粗胶原酶浓度为lmg/ml、蛋白酶的浓度为0.1 mg/ml ;所述酶洗脱液为:220ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+浓度为100 ymol/L ;所述灌流母液用超纯水配制，其中含有:130 mmol/L NaCl, 23 mmol/ L 4-轻乙基呢嘆乙磺酸，21 mmol/L葡萄糖，20 mmol /I,牛横酸，5 mmol /I,肌酸，5 mmol /T, MgCl2, 5 mmol/L 丙酬酸纳，4.5 mmol/L KC1，1 mmol/L NaH2PO4, pH 为 7.3 ;
(2)铺细胞:取步骤(I)得到的心室肌细胞离心后放入培养基中，用细胞计数器计算出心肌细胞密度，铺在培养皿上的细胞密度应控制小于14个正常杆状细胞/ cm-2；
(3)更换培养液:在细胞铺后4小时之内每隔30min慢慢更换培养液，取出死细胞，4小时之后，每3天换一次培养液。
[0005]步骤(2)所述培养基包括碳酸氢盐缓冲液和通用添加剂，所述碳酸氢盐缓冲液含有 1.8mmol/L CaCl2,116 mmol /T, NaCl, 0.6 mmol /I,醋酸纳，I mmol /T, NaHPO4, 5.3mmol/LKCl, 0.8 mmol/L MgSO4JZf述通用添加剂包括 5 mmol/L 肌酸，5mmol/L 牛磺酸，2mmol/L 左旋肉碱，2.5 mmol/L丙酮酸，10—7 mmol/L胰岛素和胞啼啶-β-D-呋喃阿拉伯糖苷，胞啼啶-β -D-呋喃阿拉伯糖苷的最终体积浓度是1%。
[0006]步骤(2)所述培养皿用层粘连蛋白液覆盖于表面至少30分钟，所述层粘连蛋白液用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为1- 5 μ g /ml。
[0007]本发明具有如下优点:该方法使用方便且培养的心肌细胞成活率高并具有极好的稳定性，减小了非心肌细胞的过度生长和可能产生的细菌污染，为心脏病研宄及新药研发提供了一个重要手段。
【附图说明】
[0008]图1是灌流装置示意图；
图2是培养至第五天的豚鼠心肌细胞照片；
图3是用全细胞电压钳记录培养至第五天的心肌细胞上内向整流钾电流Iki;
图4是用全细胞电压钳记录培养至第五天的心肌细胞上L型钙电流Ica^
图5是全细胞电压钳记录培养至第五天的心肌细胞上快速钠通道电流INa。
【具体实施方式】
[0009]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。
[0010]本发明采用的心肌分离细胞的灌注装置:如图1所示，该装置包括三个双层可预热的300毫升容量的玻璃罐1、6和7，变速蠕动泵2、加热套管3和循环桶4，玻璃罐储有灌流心脏所需要的溶液:750 ymol/L的含钙液(玻璃罐7)、无钙EGTA液(玻璃罐6)和酶解液(玻璃罐1)，灌流温度设置在36.5±0.5 C0，装置中安有开关5，有效阻止气泡进入系统而阻断冠状动脉循环。将取出的心脏系在套管3上，溶液流动由变速蠕动泵2带动。
[0011]本发明的成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，包括以下步骤:(1)急性细胞分离:Ca)将成年豚鼠麻醉后快速取出心脏放置于4 C0 750 ymol/L的含钙液中小心去除心包，轻轻挤压心脏挤出残留于心脏的淤血，找出主动脉然后系在套管3上开始心脏逆向灌注，先用含钙液灌流2min，然后用无钙EGTA液灌流5min，再用酶解液循环灌流8_10min，再用酶洗脱液灌流5min ;(b)剪下心室肌组织放入无菌培养皿，再用小剪刀切碎心室组织，(c)将切碎的心室肌组织加入到含有50毫升100 ymol/L Ca2+溶液的摇瓶中，在37° C下用自动摇晃机进行机械性分离5-10min得到细胞悬浮液，(d)将细胞悬浮液用200目(0.45微米)的尼龙纱布过滤，所得滤液中的心室肌细胞准备下一步培养；其中，所述含钙液为:300ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+浓度为750 ymol/L ;所述无钙EGTA液为:300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA浓度为3.3 μ mo I/L ;所述酶解液为:80ml灌流母液中加入CaCl2、粗胶原酶和蛋白酶，使Ca2+浓度为100 ymol/L、粗胶原酶浓度为lmg/ml、蛋白酶的浓度为0.1mg/ml ;所述酶洗脱液为:220ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+浓度为100 ymol/L ;所述灌流母液用超纯水配制，其中含有:130 mmol/L NaCl, 23 mmol/ L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，21mmol /I,葡萄糖，20 mmol /I,牛横酸，5 mmol /I,肌酸，5 mmol /T, MgCl2, 5 mmol /I,丙酬酸纳4.5 mmol/L KCl, I mmol/L NaH2PO4, pH为7.3。灌流母液需要用孔径为0.2 μ m的过滤器(用滤纸加针筒)过滤来去除微生物和微粒。
[0012](2)铺细胞:取适量步骤(I)得到心室肌细胞离心后放