一株重组大肠杆菌的构建及其合成(s)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一株重组大肠杆菌的构建及其合成 (S) _2_羟基_3_苯基丙酸的方法。
【背景技术】
[0002] 苯乳酸（phenyl lactic acid，PLA)，即2_羟基-3-苯基丙酸，3-苯基乳酸或 β -苯乳酸。PLA为淡黄色粉末，略有特殊性气味，分子式为C9H9O3，相对分子量为166,恪点 121~125 °C，对酸和热稳定。PLA是近年来发现的一种新型天然防腐剂，广泛存在于乳酸菌 发酵产品和蜂蜜中，是由多种微生物（主要是乳酸菌）中苯丙氨酸的代谢产物。这种由公认 为安全的乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸经研宄表明对人和动物细胞无毒。PLA是继乳酸 菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸和第二代抑菌物质如乳酸链球菌素（nisin)、片球菌 素（pedioein)等细菌素以外的第三代天然小分子抑菌物质。与多数天然防腐剂相比，苯乳 酸抑菌谱更广，能抑制多种食源性致病菌、腐败菌，特别是能抑制真菌污染，是使乳酸菌发 酵产物抗真菌性强和较长货架期的主要活性物质之一；溶解性好，易于在食品体系中扩散； 稳定性高，具有宽广的PH范围和热稳定性，这些优点利于其在食品工业具有广阔的应用前 景。
[0003] PLA第二个碳原子为手性碳原子，因此有（S) -2-羟基-3-苯基丙酸，即L-PLA和 (R)-2-羟基-3-苯基丙酸，即D-PLA两种对映异构体，而两种异构体对生物体的作用及其在 医药、化工方面的应用有显著差异，因此获得光学纯度高的单一对映体PLA是其在食品和 医药领域广泛应用的前提。
[0004] 前期研宄发现一些芽抱杆菌属细菌如Bacillus megaterium Z2013513 (CCTCC N0:M2013244)具有较乳酸菌相比更强的PLA合成能力，并且因其营养要求低、生长迅速、安 全性好而具有良好的开发潜力。但由于芽孢杆菌属特有的芽孢形成和同类相食效应，抑制 了 PLA合成能力的进一步提高，且只能催化产生D-PLA，但不能产生L-PLA。如果能够进一 步提高微生物合成L-PLA生产效率及高密度细胞生物合成L-PLA将具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的是提供一种L-乳酸脱氢酶基因，解决目前芽孢杆菌属细菌合 成PLA生产效率较低，只能催化产生D-PLA，但不能产生L-PLA的问题。
[0006] 本发明的第二目的是提供携带上述的L-乳酸脱氢酶基因的重组表达质粒。
[0007] 本发明的第三目的是提供含有上述重组质粒的重组大肠杆菌。
[0008] 本发明的第四目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。
[0009] 本发明的第五目的是提供上述重组大肠杆菌的用途。
[0010] 本发明的第六目的是提供上述重组大肠杆菌转化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的方 法。
[0011] 本发明通过以下技术方案来实现： 一、一种L-乳酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0012] 二、携带上述的L-乳酸脱氢酶基因的重组表达质粒pET-28a_ldhL。
[0013] 三、含有上述的载体的重组大肠杆菌。
[0014] 四、上述的重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括以下步骤： (1) 根据大肠杆菌的密码子偏好性对巨大芽孢杆菌 CCTCC NO :M 2013244 L-乳酸脱氢酶基因进行密码子优化； (2) 将密码子优化的L-乳酸脱氢酶基因导入pET-28a(+)载体得到重组表达载体 pET-28a_ldhL ; (3) 将得到的重组表达载体pET-28a-ldhL转化万.co/i BL21(DE3)后得到重组大肠杆 菌。
[0015] 五、上述的重组大肠杆菌在转化苯丙酮酸合成（S)-2_羟基-3-苯基丙酸中的应 用。
[0016] 六、上述的重组大肠杆菌转化苯丙酮酸合成（S)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法，该 方法包括以下步骤： (1) 全细胞菌悬液制备，将重组大肠杆菌单菌落接种至种子培养基中活化，再将此种子 液接种至扩大培养基中培养至对数中期，添加产酶诱导剂IPTG，低温诱导并收集菌体以获 得全细胞菌悬液； (2) 流加底物苯丙酮酸和葡萄糖，全细胞生物转化合成（S)-2-羟基-3-苯基丙酸。
[0017] 采用上述技术方案的积极效果：本发明对巨大芽孢杆菌 ?￡^ate_ri?Z2013513)CCTCC NO :M2013244 L-乳酸脱氢酶基因进行密码子优化后，构建入 表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，得到一种培养条件简单、使用方便、应用广泛的L-PLA 生产菌株；所述重组大肠杆菌经过分批转化试验、分批补料转化试验和细胞重复性转化试 验，均获得较高的PPA转化率和L-PLA产量，这为后续发酵罐连续补料提高L-PLA产量和产 率奠定了基础。
【附图说明】
[0018] 图1是重组质粒pET-28a_ldhL示意图。
[0019] 图2是工程菌SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道M是蛋白质分子质量标准；泳道 1 是万.BL21 (DE3) /pET-28a-ldhL，泳道 2 是万.BL21 (DE3) /pET-28a，泳道 3 是 B. co7i BL21(DE3) 〇
[0020] 图3是高效液相色谱法手性柱检测重组大肠杆菌全细胞分批转化液L-PLA的图 谱。实线代表转化液中PLA的检测结果，虚线代表含标准品D-PLA和L-PLA溶液的检测结 果。
[0021] 图4是底物分批补料转化合成L-PLA的时间曲线。
[0022] 图5是高效液相色谱法手性分析巨大芽孢杆菌全细胞合成PLA。实线代表转化液 中PLA的检测结果，虚线代表含标准品D-PLA和L-PLA的溶液的检测结果。
【具体实施方式】
[0023] 本发明中生物材料的来源： 1、巨大芽孢杆菌（AaciBw1S 腫Z2013513) CCTCC N0:M2013244 公开在中国专 利申请号 201410000615. 4,申请日 2014-01-02,公开日 2014-04-09,公开号 CN103710291A 中。
[0024] 2、原核表达载体 pET_28a(+)购于 Novagen。
[0025] 3、人工合成的L-乳酸脱氢酶基因以及PCR引物均委托上海生工生物合成。
[0026] 下面结合实施例和对比例对本说明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本 发明的限制： 实施例1 本实施例说明重组大肠杆菌万.co/i BL21 (DE3)/pET-28a-ldhL的构建。
[0027] I. L-乳酸脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(CCTCC NO :M2013244)，根据大肠杆菌密码子偏好性对L-LDH基因进行密码子优化，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 所示。
[0028] 2.经人工合成获得密码子优化的L-乳酸脱氢酶基因，设计上下游引物，引物序列 如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。经PCR扩增后核酸琼脂糖凝胶电泳胶回收，连接到 PMD19-T载体，将克隆载体转化