L-赖氨酸基因工程生产菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种L-赖氨酸基因工程生产 菌。
【背景技术】
[0002] L-赖氨酸作为人类和动物必需的氨基酸之一，在饲料添加剂、食品强化剂和医药 产品等方面被广泛使用，其中约90%用于饲料工业，10%用于食品和医药行业。目前，L-赖 氨酸已是世界上第二大氨基酸品种。
[0003] L-赖氨酸的生产方法主要有四种，分别是提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵 法，前三种方法由于前体物成本高、工艺复杂等缺点，难以达到工业化生产的目的，发酵法 制备L-赖氨酸是当前的主要生产方式。发酵法生产L-赖氨酸的微生物主要是谷氨酸棒杆 菌和大肠杆菌，黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌等也有使用。
[0004] 利用谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌生产L-赖氨酸，多采用诱变方法获得高产菌 株。1960年日本的木下祝郎、中山清等经紫外诱变获得了一株谷氨酸棒杆菌营养缺陷 型菌株，开始了发酵法生产 L-赖氨酸。Chaudhuri A(Chaudhuri A, Mishra AK, Nanda G. Lysine excretion by S_(2-aminoethyl)L-cysteine resistant mutants of Bacillus subtilis.Acta Microbiol Pol. 1983 ;32(1):37_45.)等以枯草芽抱杆菌为出发菌株，经 MNNG诱变处理后，利用AEC平板进行抗反馈抑制天冬氨酸激酶突变株的筛选，再利用紫外 诱变，获得了产酸达21g/L的突变株。但是由于谷氨酸棒杆菌和短杆菌的最适生长温度是 30度，生产效率在一定程度上制约了大规模发酵生产赖氨酸的需求，另外传统诱变方法由 于其局限性，获取高产菌株的难度非常大。
[0005] 随着基因工程技术的发展，大肠杆菌作为背景研宄得最为清楚的模式微生物，具 有生长速度快，遗传操作方法成熟的特点，适合作为宿主菌发酵生产赖氨酸。大肠杆菌 合成赖氨酸通过天冬氨酸途径，从天冬氨酸开始，经过九步酶催化途径合成赖氨酸。天 冬氨酸激酶（IysC编码）作为合成途径中的第一个关键酶，受该途径的末端产物赖氨 酸反馈抑制，Brigitte Dauce-Le Reverend (Brigitte Dauce-Le Reverend, Middle Boitel, Alain M. Deschamps,et al. Improvement of Escherichia coli strains overproducing lysine using recombinant DNA techniques. European J Appl Microbiol Biotechnol (1982) 15:227-231.)等报道的高产赖氨酸的大肠杆菌TOC R21中的IysC发生 了突变，天冬氨酸激酶活力较野生型提高了 10倍。二氢吡啶二羧酸合酶（dapA编码）作为 赖氨酸生物合成分支途径中的第一个酶，也是控制L-赖氨酸产量的最主要酶，在大肠杆菌 中，dapA被赖氨酸抑制；而在黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌中，dapA不被末端产物赖氨酸抑 制，Jong -Won Oh(Jong-Won Oh, Jin-Ho Lee Kap-Soo Noh, Hyune-Hwan Lee, et al. Improved L-Iysine production by the amplification of the Corynebacterium glutamicum dapA gene encoding dihydrodipicolinate synthetase in E. coli. Biotechnology letters Vol 13No 10,727-737(1991).)等将谷氨酸棒杆菌的dapA基因在大肠杆菌中进行过表达， 提高了赖氨酸产量。日本味之素申请的专利US6040160中，报道了解除dapA、IysC反馈抑 制作用的突变位点，增强了大肠杆菌L-赖氨酸合成途径相关基因的表达，过表达了来源于 谷氨酸棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因（ddh)，可直接催化四氢二吡啶二羧酸转化为二 氨基庚二酸，提高了 L-赖氨酸产量，糖酸转化率达到了 30% ;在EP0796912A1专利中，同时 失活L-赖氨酸脱羧酶基因 cadA和ldcC，减少了 L-赖氨酸降解，使赖氨酸产量增加了约2. 3 倍。
【发明内容】
[0006] 本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，并根据代谢流分析，增强L-赖氨酸合成 途径的相关基因，弱化分支代谢途径，筛选获得一株L-赖氨酸高产菌株CCTCC M 2015232， 能有效的积累L-赖氨酸，具有广泛的工业应用价值。
[0007] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌。
[0009] 本发明的第三个目的在于提供一种L-赖氨酸的生产方法。
[0010] 本发明的第四个目的在于提供所述L-赖氨酸基因工程生产菌用于生产L-赖氨酸 的应用。
[0011] 为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0012] 根据本发明的第一个方面，一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下 步骤：
[0013] A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲 除的基因选自：cadA、ldcC、gltl、thrC、cynT、thrL和maeB中的一个或多个；
[0014] B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因 增强菌株，所述增强的基因选自：ybjE和cyo operon中的一个或多个；
[0015] C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所 述过表达的基因选自 dapA* (H118Y)、IysO (M318I, G333D)、dapB* (I114T)、ddh、ppc、aspA、 pntAB和asd中的一个或多个；
[0016] D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述 基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基因工程生产菌。
[0017] 根据本发明的优选实施例，所述的L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法包括以 下步骤：
[0018] A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲 除的基因为 cadA、ldcC、gltl、thrC、cynT、thrL 和 maeB ;
[0019] B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因 增强菌株，所述增强的基因为ybjE和cyo operon ;
[0020] C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所 述过表达的基因为 dapA*(H118Y)、lysC*(M318I，G333D)、dapB*(I114T)、ddh、ppc、aspA、 pntAB 和 asd ;
[0021] D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基 因工程生产菌。
[0022] 根据本发明，所述原始菌株为大肠杆菌。
[0023] 根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
[0024] 根据本发明的第二个方面，根据如上所述的方法构建获得的L-赖氨酸基因工程 生产菌。
[0025] 根据本发明，一种L-赖氨酸基因工程生产菌，保藏号为CCTCC M 2015232。
[0026] 根据本发明的第三个方面，一种L-赖氨酸的生产方法，通过发酵如上所述的L-赖 氨酸基因工程生产菌生产。
[0027] 根据本发明的优选实施例，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L， (NH 4) 2S0416g/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 · 7H20 1.0 g/L，FeSO4 · 7H20 0· 01g/L，MnSO4 · 7H20 0· 01g/L，酵母粉 2g/L，CaC0330g/L，KOH 调 pH7. 0。
[0028] 根据本发明的第四个方面，如上所述的L-赖氨酸基因工程菌可用