瓜蔓枯病菌荧光pcr检测方法及所用引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及瓜蔓枯病菌荧光PCR检测方法及所用引物和探针。
【背景技术】
[0002] 瓜蔓枯病病状：主要为害多种瓜蔓，同时也为害叶片和果实。蔓发病初期节部产生 油浸状褪色裂纹，并分泌出胶脂。病情严重时，蔓上裂纹部位出现爆裂，主蔓基部裂开口还 会流出灰、红色胶状液体，俗称"爆血管";侧蔓裂开后，产生白色油状物。部分植株出现生长 发育缓慢或停止生长；重者全株死亡，蔓干燥后呈赤褐色。
[0003] 瓜蔓枯病菌长距离传播主要依靠感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性 材料。瓜蔓枯病菌在瓜的整个生育期地上各部均可受害，以叶片、瓜蔓受害最为严重，但主 要危害茎基部。目前国内未见报道有关检测该病菌的荧光PCR特异性引物和探针。目前瓜 蔓枯病菌的检验方法主要是常规种子带菌检验。这种方法经验性较强，主要表现在：（1)瓜 蔓枯病菌和其他近似病原菌在形态上较难区分；（2)瓜蔓枯病菌的有性态只存在于病残体 上，很难诱发。因此建立对瓜蔓枯病菌快速、准确的检测方法至关重要。
[0004] 所涉及的参考文献如下：
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【发明内容】
[0016] 本发明要解决的技术问题是提供一种瓜蔓枯病菌荧光PCR检测方法及所用引物 和探针，采用本发明方法检测瓜蔓枯病菌具有特异性、稳定性和灵敏性都非常好的特点。
[0017] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于瓜蔓枯病菌荧光PCR检测方法的引 物和探针；
[0018] 本发明从GenBank查询所有瓜蔓枯病菌的beta-tubulin相关序列，设计瓜蔓枯病 的特异性引物和TaqMan探针，具体如下：
[0019] 引物：
[0020] Db-5 :5, -CGTAAGTAGACCTCCACCAC-3，
[0021] Db-7 :5, -CGAAGTGCCATTGTAGACA-3,；
[0022] TaqMan 探针：
[0023] Db-P :5' FAM-TCACTTCTCAACAACAGCGGCTT-3' TAMRA。
[0024] 备注说明：产物大小140bp。
[0025] 本发明还同时提供了利用上述特异性引物和TaqMan探针进行的瓜蔓枯病的实时 荧光PCR方法，包括以下步骤：
[0026] 1)、提取待测植物材料（包括种子等）的DNA ;
[0027] 2)、PCR 反应：
[0028] 采用 25 μ L 反应体系：10 X Buffer 2. 5 μ L，25mmol/L Mg2+2 μ L，2. 5mmol/L dNTP 0· 5yL，5U/yL TaqMan 聚合酶 0· 2yL，上下游引物（10ymol/L)各 0· 5yL，TaqMan 探针 (10 μ mol/L) (λ 5 μ L，模板DNA :0· 5-2 μ L，最终用三蒸水补足至25 μ L。
[0029] 反应程序为：95°C 3min ; (95°C 15s，58. 4°C lmin，40 个循环），反应中止。
[0030] Mg2+具体为 MgCl2;
[0031] 3)、能检测到荧光（Ct值小于40)为阳性，否则为阴性。
[0032] 备注说明：
[0033] 在发明过程中，所使用的荧光PCR仪中温度梯度所用PCR为Eppendorf荧光PCR 仪。确定退火温度后所用的荧光PCR仪为ABI公司7300。
[0034] 本发明在发明过程中：使用瓜蔓枯病菌ATCC201923样品DNA进行体系参数优化。 实时荧光PCR进行两步反应，对复性-延伸温度进行了优化，分别进行了 57°C~64°C 12个 不同温度的测试；Mg2+浓度从Ommol/L到4mmol/L (指在25 μ L反应体系中的浓度，即，本发 明最终设定的为2mmol/L)共9个均匀递增的浓度梯度。
[0035] ITS序列由于真菌种类的不同而经常发生变异，它弥补了核糖体DNA上其他区域 序列（18S、5. 8S和28S)的保守性强、进化速度慢、分化水平低的不足，表现出极大的序列多 态性。因而，在核糖体DNA各区域序列中，ITS区域序列显得更为有效，可用于种水平上的 分类鉴定。
[0036] 真菌的分子鉴定最常用的是rDNA上的18S、5.8S和28S及其ITS基因序列，由于 ITS的序列分析能反映出属间、种间以及菌株间的序列差异，而且ITS序列片段较小、容易 分析，已经被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研宄中，但是在瓜蔓枯 病菌的序列比对中该区段很难找到突变位点设计探针。
[0037] 本发明选择瓜蔓枯病菌的beta-tubulin基因设计引物探针序列，通过对瓜上其 他病害和瓜蔓枯病菌的检测研宄，结果表明该方法特异性、稳定性和灵敏性都非常好。
【附图说明】
[0038] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0039] 图1是不同退火温度Tm值对实时荧光PCR检测体系的影响（FiglThe influence of different temperature melt on the Real-Time PCR system)；
[0040] I ：57. 1°C ；2 ：57. 3 °C ；3 ：57. 8°C ；4 ：58. 4°C ；5 ：59. 4°C ；6 ：60. 2°C ；7 ：61. 2°C ；8 ： 62. 2°C ;9 :63°C ;10 :63. 6°C ;11 :64°C ;12 :64. 1°C ;13 :空白对照。
[0041] 图2是不同Mg2+浓度对实时荧光PCR检测体系的影响（Fig2The influence of different Mg2+concentration on the Real-Time PCR system)；
[0042] I :0 μ I ;2 :0· 5 μ I ;3 :1 μ I ;4 :1. 5 μ I ;5 :2 μ I ;6 :2. 5 μ I ;7 :3 μ I ;8 :3. 5 μ I ; 9 ：4 μ l〇
[0043] 图3是不同DNA浓度对实时荧光PCR检测体系的影响（Fig3The influence of different DNA concentration on the Real-Time PCR system)；
[0044] I :8. 9ng(原液）；2 :89(^8(10-1) ;3 :89pg(l(T2) ;4 :8. 9pg(l(T3) ;5 :890fg(l(T4); 6 :89fg(l(T5) ;7 :8. 9fg(l(T6) ;8 :890ag(l(T7) ;9 :0。
[0045] 图4是实时焚光PCR产物电泳检测结果（Fig4 :Agarose gel electroph