蓝莓休克病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于农业生产及进出境口岸上蓝莓休克病毒的快速检测和监测。
【背景技术】
[0002]蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus，BlShV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)成员，最早于1987年在美国的Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.)上发现。BlShV 现主要分布于美国的加利福尼亚、宾夕法尼亚州、纽约州、密歇根州和加拿大的新斯科舍省，该病毒基因组为+ssRNA，全长9650个核苷酸，病毒粒体呈等轴对称球状，直径约27nm。BlShV已报道的自然寄主为蓝莓，人工侵染寄主有本氏烟(Nicotiana benthamiana)、克利夫兰烟(Nicotianaclevelandii)、林烟草(Nicotiana sylvestris)和普通烟草(Nicotiana tabacum)。BlShV侵染蓝莓后引起的主要症状是开花期时花和叶片的突然完全坏死，但之后除引起不结果夕卜，叶片仍会长出。受BlShV侵染的蓝莓通常在I?4年内表现症状，随之逐渐恢复并隐症。BlShV几乎可侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状。据统计，BlShV侵染蓝莓造成的损失达34%?90%，损失大小与症状严重程度直接相关，且不同年份之间存在差异。BlShV可通过蜜蜂携带感染的花粉传播，因此在田间扩散速度相对较快。为预防和控制该病毒的发生和传播，建立有效的检测方法具有重要意义。
[0003]在普通RT-PCR基础上建立的巢式RT-PCR技术，具有快速、准确、灵敏和特异性强的突出优点，能够有效降低多个靶标被扩增的可能，避免假阳性的出现。但到目前为止，关于蓝莓休克病毒(BlShV)巢式RT-PCR检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于该病毒快速检测的巢式RT-PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对农业生产及进出境口岸上蓝莓休克病毒进行快速、准确的检疫鉴定。
[0005]本发明技术方案如下:
[0006](一 ) 一种用于蓝莓休克病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0007]I)正向引物:10ymol/L，引物序列为 5’ -CCCCAAAGGATAAACAGGTCCA-3’ ；
[0008]2)外侧反向引物:10 ymol/L，引物序列为 5’ -TCACCACGTACAAATCCCT-3’ ；
[0009]3)内侧反向引物:10 ymol/L，引物序列为 5’ -CCCACCCAACCATTACCGAT-3’ ；
[0010]4)RT Buffer:5X ；
[0011]5)RNA 酶抑制因子:40U/yL ;
[0012]6)反转录酶:200U/ μ L ；
[0013]7) dNTPs: 10mmol/L ;
[0014]8) PCR Buffer:10 X ;
[0015]9)Mgcl2:25mmol/L ；
[0016]10)Taq DNA 聚合酶:5U/yL ;
[0017]11)蓝莓休克病毒的阳性对照样品；
[0018]12)不含蓝莓休克病毒的阴性对照样品；
[0019]13) RNase-free ddH20o
[0020](二)上述蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0021]I)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA 3 μ L、浓度为10 μ mo I/L的外侧反向引物I μ L和RNase-free ddH20 7 μ L，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5XRT Buffer 5 μ L、浓度为 10mmol/L dNTPs 2 μ L、浓度为 200U/μ L反转录酶 I μ L、浓度为40U/ μ L RNA酶抑制因子I μ L，42°C水浴60min，70°C水浴lOmin，合成cDNA ；
[0022]2)第I轮PCR反应:取步骤I)合成的cDNA 2 μ L，按每管加浓度为5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0.5 μ L、浓度为 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5 μ L、浓度为 25mmol/L MgCl22 μ L、浓度为10 ymol/L正向引物I μ L、浓度为10 ymol/L外侧反向引物I μ L、RNase-free ddH2015.5 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，94°C预变性5min，然后94°C变性30s、56°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；
[0023]3)第2轮PCR反应:取0.1 μ L稀释100倍后的第I轮PCR反应产物，按每管加浓度为 5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L、浓度为 10mmol/L dNTPs 0.5 yLUOXPCR Buffer2.5 yL、浓度为 25mmol/L MgCl22 yL、浓度为 10 ymol/L 正向引物 I yL、浓度为 10 ymol/L内侧反向引物I μ L,RNase-free ddH20 17.4 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、60°C退火45s、72°C延伸45s，如此共30个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；
[0024]4) PCR扩增产物电泳检测:取第2轮PCR反应产物10 μ L用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有蓝莓休克病毒样品的电泳检测结果为在241bp处出现明亮的DNA条带。
[0025]根据已报道的蓝莓休克病毒外壳蛋白CP基因序列设计3条特异性引物，以提取RNA反转录合成的cDNA作为模板，进行第I轮PCR扩增，再以第I轮PCR扩增产物作为模板进行第2轮PCR扩增，其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0026]较现有技术而言，本发明所提供的蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于:
[0027]I)灵敏度高:本发明经过2轮PCR反应，使检测灵敏度呈数量级增长，从而实现对微量模板样品的检测。本发明相对于普通PCR技术，检测蓝莓休克病毒的灵敏度提高了 13倍，对于不表现症样品或携带蓝莓休克病毒含量少的样品检测具有重要应用价值。
[0028]2)特异性强:内侧反向引物的扩增位点位于外侧反向引物的扩增位点内部，非目的片段同时包含这2条引物结合位点的可能性极小。通过使用2条内外侧反向引物进行巢式PCR，大大提高了检测的特异性。本发明能够从感染蓝莓休克病毒的样品上扩增到大小为241bp的特异性目的片段，而从健康样品及其他病毒样品上均未扩增到大小为241bp的特异性目的片段，结果证实本发明具有很强的特异性。
[0029]3)操作简便、检测时间快:本发明提供的检测方法操作简便、检测时间快，有效克服了传统病毒检测方法灵敏度不高的缺点，实现对蓝莓休克病毒的快速、准确和高效检测。
【附图说明】
[0030]图1为实施例2的蓝莓休克病毒检测结果。其中M:DNA分子量标准(10bp) ；1:阳性对照；2:携带有蓝莓休克病毒的样品；3:阴性对照；4:空白对照。
[0031]图2为实施例3的特异性测定结果。其中M:DNA分子量标准(10bp) ；1:阴性对照；2:蓝莓休克病毒(BlShV)样品；3:蓝莓带化病毒(BSSV)样品；4:蓝莓叶斑驳病毒(BLMoV)样品；5:烟草环斑病毒(TRSV)样品；6:番前环斑病毒(ToRSV)样品；7:蓝莓焦枯病毒(BLScV)样品。
[0032]图3为实施例4的第I轮PCR测定结果。其中M:DNA分子量标准(10bp) ； I:RNA原液；2: 10 1稀释；3: 10 2稀释；4: 10 3稀释；5: 10 4稀释；6: 10 5稀释；7: 10 6稀释；8: 10 7稀释。
[0033]图4为实施例4的第2轮PCR测定结果。其中M:DNA分子量标准(10bp) ； I:RNA原液；2: 10 1稀释；3: 10 2稀释；4: 10 3稀释；5: 10 4稀释；6: 10 5稀释；7: 10 6稀释；8: 10 7稀释；9:10_8稀释；10:10 _9稀释；11:10 _1(1 稀释。
【具体实施方式】
[0034]以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0035]实施例1:蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
[0036]I)正向引物:10 ymol/L, I 管(30 μ L);
[0037]2)外侧反向引物:10ymol/L，l 管(30 μ L)；
[0038]3)内侧反向引物:10ymol/L，l 管(30 μ L)；
[0039]4) RT Buffer:5 X，I 管(30 μ L)；
[0040]5) RNA 酶抑制因子:40U/ μ L，I 管(5 μ L)；
[0041]6)反转录酶:200U/ μ L，I 管(5 μ L);
[0042]7) dNTPs: 10mmol/L，I 管(30 μ L)；
[0043]8) PCR Buffer: 10 X，I 管(60 μ L)；
[0044]9)Mgcl2:25mmol/L，I 管(50 μ L)；
[0045]10) Taq DNA 聚合酶:5U/ μ L，I 管(10 μ L)；
[0046]11)蓝莓休克病毒的阳性对照样品，I管(50 μ L)；
[0047]12)不含蓝莓休克病毒的阴性对照样品，I管(50 μ L);
[0048]13) RNase-free ddH20，I 管(ImL)0
[0049]实施例2:蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法
[0050]上述蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
[0051]I)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA 3 μ L、浓度为10 μ mo I/L的外侧反向引物I μ L和RNase-free ddH20 7 μ L，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5XRT Buffer 5 μ L、浓度为 10mmo