基因工程酵母的制作方法
【专利说明】基因工程酵母
[0001] 本发明涉及基因工程酵母和它们在生产3-羟基丙酸（3HP)的方法中的用途。
[0002] 3HP是一种平台化合物，其可转化成丙烯酸、1，3-丙二醇、丙二酸和其他有价值的 产品。源自丙烯酸的产品包括用于婴儿尿布和失禁产品、各种塑料、涂料、粘合剂、弹性体和 油漆中的超强吸收性聚合物。目前，丙烯酸来自丙烯，丙烯是乙烯和汽油生产中的一种副产 物。从葡萄糖或其他可再生碳源建立3HP生产将针对从化石资源的丙烯酸生产提供生物可 持续的替代方案。已经描述了几种从葡萄糖生产3HP的方法。但是，具体的教导主要使用 细菌大肠杆菌作为宿主。本发明使用酵母作为生产3HP的宿主。这使得能够在低pH下进 行该过程并且因此使该过程总体更经济。
[0003] US2010/0136638大体描述了在包括酵母的微生物中通过生物催化从0 -丙氨酸 生产3-HP。据称丙氨酸可在细胞中利用具有丙氨酸2, 3-氨基变位酶活性的酶由a-丙 氨酸合成，并且给出了相关酶的序列。
[0004] 也公开了使用0 -丙氨酸/丙酮酸转氨酶（BAPAT)序列由0 -丙氨酸生产3-HP 的方法。公开了具有BAPAT活性的转化细胞，其使得细胞能够将丙氨酸通过丙二酸半 醛中间体转化成3-HP。
[0005] 尽管提到了在酵母中进行这种工作的可能性，但并没有实践证据。我们发现，在 大肠杆菌中有效的该通路中的酶在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中是无效的。 尤其是，根据US2010/0136638,具有BAPAT活性的酶可获得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)或铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。但是，我们已经发现编码这些酶的 基因在酿酒酵母中是无效的。
[0006] 丙二酸半醛（或丙二酸半醛或3-氧代丙酸）是产生3HP的一个通路中的关键中 间体，但是可能有许多生产3HP的不同路径。
[0007] US2012135481描述了酵母中的包括编码gabT、3-HPDH和HIBADH基因和其他基因 的3HP产生通路。但是，需要其他的和更好的生产3HP的酵母。
[0008] 我们现已发现，当异源表达来自赌状芽孢杆菌（Bacillus cereus)AH1272的未表 征的转氨酶yhxA时，在酵母酿酒酵母中获得了由|3 -丙氨酸生产的3HP。所述yhxA编码的 转氨酶的氨基酸序列列于SEQ ID N01中，并且DNA序列列于SEQ ID N02中。SEQ ID N02 针对酿酒酵母进行了密码子优化。
[0009] 我们认为，来自蜡状芽孢杆菌AH1272的所述转氨酶YhxA催化0 -丙氨酸和丙酮 酸之间的氨基转移反应，产生L-丙氨酸和丙二酸半醛，在这种情况下，酶应该是0 -丙氨 酸-丙酮酸转氨酶 E. C. 2. 6. 1. 18 (BAPAT)，而不是 gabT (E. C. 2. 6. 1. 19)。
[0010] US2012/0135481大体公开了一种基因修饰酵母细胞，其包含包括BAAT基因（0丙 氨酸氨基转移酶-EC 2. 6. 1. 19)的活性3-HP发酵通路，BAAT基因催化[0 ]-丙氨酸转化 成丙二酸半醛。所以，这里的BAAT与天然存在的或基因修饰的gabT同义。但是，并未表明 通过该方法成功生产了 3-HP。
[0011] W02005/118719公开了在酵母细胞中使用来自任何生物体的0-丙氨酸/丙酮酸 转氨酶（BAPAT)序列由0 -丙氨酸生产3-HP的方法，但是并未表明该方法的有效性。这里， 经鉴定的BAPAT的来源包括假单胞菌、拟南芥、大鼠和非洲爪蟾。如上所述，我们已经确认， 来自假单胞菌的BAPAT基因在酿酒酵母中是无效的。
[0012] yhxA的Uniprot条目提供了序列，但并未将该酶鉴定为BAPAT。
[0013] 因此，本发明现在提供了基因修饰酵母细胞，其包含生产3-HP的活性发酵通路， 其中，所述细胞包含并表达编码用于产生酶的外源性基因，所述酶与SEQ ID N0 :1具有至少 80%的同一性并催化0 -丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛。
[0014] 优选地，所述酵母也表达3-羟基异丁酸脱氢酶（HIBADH)和/或3-羟基丙酸脱氢 酶（3-HPDH)，3-羟基异丁酸脱氢酶适当地来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、 恶臭假单胞菌（P.putida)、赌状芽孢杆菌（Bacillus cereus)或白色念珠菌（Candida albicans)，3_羟基丙酸脱氢酶任选地来自勤奋生金球菌（Metallosphaera sedula)、头寇 15硫化叶菌（Sulfolobus tokadaii)或大肠杆菌（E.coli)。
[0015] 为了能够直接从葡萄糖合成3-羟基丙酸，优选另外重新构建从丙氨酸至 3-羟基丙酸的通路以表达异源天冬氨酸1-脱羧酶，优选以昆虫合成，优选以红色面粉甲虫 (赤拟谷盗（Tribolium castaneum))合成。为了进一步增加朝着3-羟基丙酸的流量，优选 过表达丙酮酸羧化酶和/或PEP羧化酶和天冬氨酸转氨酶。另外，缺失丙酮酸脱羧酶活性 (PDC1、H)C5、PDC6)或乙醇脱氢酶（ADH)活性会使得进行厌氧发酵而不形成作为副产物的 乙醇。
[0016] 根据本发明的菌株可使用适应性实验室进化方法进化，以改善葡萄糖耐受、去除 乙酸酯依赖性并增加3HP的生产。
[0017]酵母优选是酿酒酵母，但可以是克鲁弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、解脂耶 氏酵母（Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、汉逊德巴 利酵母（Debaryomyces hansenii)、产版假丝酵母（Cyberlindnera jadinii)、小红酵母 (Rhodotula minuta)、粘红酵母（Rhodotula glutinis)、戴耳克氏圆抱酵母（Torulaspora delbrueckii)、树干毕赤酵母（Pichia stipitis)、巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris)、 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)或其他酵母。
[0018] 适于根据本发明修饰的酵母菌株可根据它们对于在存在3HP的情况下的生长的 耐受来选择。
[0019] 可对蜡状芽孢杆菌AH1272的天然（native) yhxA表达产物的氨基酸序列和编码它 的DNA序列进行修饰，以各种方式在本发明中使用。首先，DNA序列可进行密码子优化，用 于在适当的酵母中表达。第二，可通过氨基酸的缺失、添加或置换对氨基酸序列进行修饰， 而不干扰、或者实际上增加酶的活性。这种经修饰的酶可与天然氨基酸序列具有至少80% 的同源性，更优选至少85 %、或90 %或95 %的同源性。
[0020] 本发明包括生产3HP的方法，其包括培养本发明的酵母细胞和任选地从培养物回 收3HP。培养可在包括丙氨酸或除所述酵母之外的丙氨酸来源的培养基中进行。 所述来源可以是另一微生物。但是，本发明的酵母可被工程化以生产丙氨酸，例如，适 当地通过组入产生天冬氨酸-1-脱羧酶（EC 4. 1. 1. 11)或谷氨酸脱羧酶（EC 4. 1. 1. 15)的 外源性基因从L-天冬氨酸生产0 -丙氨酸，或利用2, 3-丙氨酸氨基变位酶由L-丙氨酸生 产丙氨酸。由于其在合成泛酸酯中的作用，天冬氨酸1-脱羧酶也称为PanD。野生型酿 酒酵母的基因组中不存在该酶的基因。
[0021] 我们已经发现，使用某些编码天冬氨酸-1-脱羧酶的外源性PanD基因相比其他基 因可获得优异的结果。尤其，我们已经发现来自昆虫、尤其面粉甲虫、更尤其红色面粉甲虫 (Tribolium castaneum，赤拟谷盗）的PanD基因，与细菌PanD基因相比，提供3-HP的更好 的生产滴度和更好的产率。
[0022] 优选地，通过所述酵母生产3HP的产量为，由每升培养基生产、或从每升所述培养 基回收至少l〇〇mg 3HP，更优选至少200、或300、或400或500或1000或2000或14000mg/ 1〇
[0023] 在下述非限制性实施例中进一步描述和阐释本发明，其中，参考了下表。
[0024] 表1.引物
[0026] 表2.中间质粒
[0027]
[0028] 表3.用于通过PCR产生USER克隆的基因片段的引物和模板
[0031] 表4?表达质粒
[0033]
[0034] *pTY为通过靶向TY重复区域多重整合入染色体而设计的载体。该载体包含与表 4中列举的其他亲本质粒相同的USER克隆盒。
[0035] 表5.添加了 0-丙氨酸的培养中的菌株和3HP滴度