霉菌、番木瓜籽和胰酶的脂肪酶，但不限于此。
[0162] 脂肪酶可共同固定在合适的支持体上，具体是在基于疏水性脂族聚合物或共聚合 物的支持体、或者疏水性芳族聚合支持体上。额外地和可选地，当使用超过一种脂肪酶时， 每种所述脂肪酶可被固定在合适的支持体上，其中所述脂肪酶固定在其上的支持体是相同 或不同的。采用的脂肪酶对其底物可以是区域特异性的、或者是随机的。共固定在相同支 持体上的脂肪酶可对其底物展示出相同或不同的底物选择性或区域特异性。脂肪酶关于甘 油主链上的脂肪酰基的链长或关于碳链上的双键的位置可以是区域特异性或选择性（或 位点特异性）的，每个单独使用或与相同或不同位点特异性的脂肪酶组合使用。当提及位 置sn-l、sn-2-或sn-3时，这些为各种甘油酯的甘油主链上的位置。因而，在本公开的主题 的方法中使用的脂肪酶对于sn-2位置可具有比随机脂肪酶更高的选择性，即它们倾向于 催化醇或醇供体与sn-2位置的脂肪酰基之间的反应，而随机脂肪酶对甘油主链上的所有 三个位置处的脂肪酰基都展示出相同的转酯活性。一些脂肪酶独特地展示出在sn-2位置 上的位置活性，特别是在由底物、产物等所决定的特定条件下。在本公开的主题的方法中使 用的其它脂肪酶是sn-1，3位置特异性的。它们可单独使用或与随机脂肪酶、具体对偏甘油 酯具有亲和力的脂肪酶和任选地对sn-2位置具有高亲和力的第三脂肪酶一起使用。
[0163] 支持体具体是多孔和大网络疏水性支持体，其可以是有机的或无机的。支持体的 实例是多孔无机支持体诸如但不限于基于疏水化二氧化硅或氧化铝的支持体，以及疏水性 有机支持体诸如但不限于聚合支持体或基于聚合物的支持体。支持体可任选地包含选自环 氧基或和醛基，或离子基团的活性官能团。
[0164] 在本公开的主题的方法中使用的特定不溶性支持体可以是基于多孔和网状疏水 性脂族或芳族聚合物的支持体，诸如Amberlite K XAD1600和S印abeadsK SP70,二者均由自 二乙烯基苯或自二乙烯基苯和聚苯乙稀的混合物制备的多孔大网络树脂组成；AmberliteK XAD7HP，其由大网络脂族丙烯酸聚合物组成；以及多孔脂族聚合物，诸如多孔聚丙烯 (AccurelK)。其它特定支持体可以是由二乙烯基苯或二乙烯基苯和苯乙稀的混合物组成 的网状疏水性聚合物，和由脂族丙烯酸聚合物或聚烯诸如聚丙烯组成的网状疏水性脂族聚 合物。特定支持体是孔径在25A至1000A的范围和更具体在50A至200A的范围 的多孔基质。因而，孔径的范围可以是25A至1000A、25A至500A、50A至 500A、50人至300A、或50A至200人、或其间的任意范围。支持体还可以是粉末 状或颗粒状多孔疏水性二氧化硅或其它无机氧化物。支持体还可以是粉末状或颗粒状多孔 疏水化二氧化硅或其它无机氧化物。在【具体实施方式】中，支持体树脂的表面积高于100m2/ g。应当注意，亲水性质的树脂倾向于吸附甘油和水，导致反应器系统的阻塞。
[0165] 待补充入脂肪酸源和醇之间的脂肪酶催化的转酯/酯化反应中的碱性或弱碱性 含水缓冲溶液或水--如上所述的游离的或与一种多元醇/多种多元醇例如甘油以不同比 例混合的一一的量通常依据其它反应条件、起始物料、生物催化剂等调节。如本文叙述和示 例的，此量可以变化。此碱性溶液例如由无机碱性碱或盐制备，或者由有机碱性碱制备。无 机碱和盐是例如碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐和柠檬酸盐。 有机碱可以是例如伯胺、仲胺或叔胺，或者诸如甘油、丙二醇和糖的一种多元醇/多种多元 醇。也考虑这些碱性试剂的混合物。在根据本公开的主题的方法的实施方式中，固定化酶 的微环境的pH可被维持在大约5. 5至大约9的pH值下。
[0166]脂肪酸烷基酯的生产通过转酯或酯化同时或顺序地进行。在这样的反应处理系统 中，生物催化剂活性在多次使用中得以维持，而无显著的活性损失，并且还避免了甘油和水 副产物或其它亲水性化合物在生物催化剂上的聚积。
[0167] 本公开的主题提供了采用在许多生产循环中保留高活性和稳定性的特定固定化 界面酶的方法。具体地，在转酯/酯化反应中使用脂肪酶和磷脂酶制剂。这些反应可用于 生产食品、化妆品和生物燃料（"生物柴油"）。特别感兴趣的是，这些酶可被用于合成用作 "生物柴油"的脂肪酸短链烷基酯。
[0168] 本公开的主题采用稳定的固定化界面酶，其对短链醇诸如甲醇、乙醇和甘油以及 短链脂肪酸诸如乙酸具有高耐受性。这些酶制剂的使用也防止了亲水性物质特别是甘油和 水在固定化生物催化剂上的聚积。
[0169] 在本公开的主题的方法中采用的醇或醇供体可以是短链烷基醇，特别是(^-(： 6烷 基醇，更特别是Ci-C；烷基醇，并且具体为甲醇或乙醇，或者醇供体可以是单烷基酯或碳酸 二烷基酯，诸如碳酸二甲酯。诸如，例如碳酸二烷基酯的醇供体也可充当用于反应处理系统 的碱性或弱碱性的来源。
[0170] 所公开和所描述的，应当理解此本公开的主题不限于本文公开的具体实例、方法 步骤和材料，因为这样的方法步骤和材料可以有所变化。还应当理解的是，本文使用的术语 仅是用于描述【具体实施方式】的目的，并不意欲是限制性的，因为本公开的主题的范围仅由 所附权利要求及其等同物限定。
[0171]必须要注意的是，除非上下文另外明确地指出，如在本说明书和所附权利要求中 使用的单数形式"一（a) "、"一（an)"和"所述（the)"包括复数指代物。
[0172] 贯穿本本说明书和所附的权利要求书，除非上下文另外要求，词语"包括 (comprise) "和变型诸如"包括（comprises) "和"包括（comprising) "应理解为暗示包括 所述整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除其它任意整数或步骤或整数组或步骤组。
[0173] 下列实施例是本发明人在进行本公开主题的方面中采用的技术代表。应当理解的 是，虽然这些技术示例了用于实践本公开的主题的实施方式，但根据本公开内容，本领域技 术人员将认识到在不偏离本公开主题的预期范围的情况下可做出许多修改。
[0174] 实施例
[0175] 材料和方法
[0176] 遍並廬显定:遵循标准程序，诸如在申请人的W02011/107977中公开的那些程序 固定脂肪酶，所述专利通过引用并入本文。简而言之，衍生自特定来源，诸如微生物的脂肪 酶溶解于适合的pH值，通常是7. 5的0. 1M的缓冲溶液中。将疏水性有机或无机聚合物树 脂添加入脂肪酶溶液中。在室温下摇动混合物8小时。然后过滤混合物并干燥固定化酶以 将水含量减小至小于10%。
[0177] 使用不同的树脂，其包括基于聚苯乙烯/二乙烯基苯的多孔疏水性聚合物 树脂、石蜡或其任意组合。使用的典型疏水性树脂包括多孔大网络二乙烯基苯/聚 苯乙烯（DVB-PS)树脂，诸如 AmberliteK XAD1600(Rohm&Haas，美国）和 S印abeadsK SP70(Resindion，意大利）或其它等效树脂。
[0178] 衍生自产碱杆菌属某种（AL)、假单胞杆菌属某种（PS)和疏棉状嗜热丝孢菌（TL) 的固定在作为疏水性树脂的多孔DVB-PS上的脂肪酶被用于不同原料的转酯/酯化反应， 所述原料包括精炼或粗植物油、动物脂肪、餐饮废油、润滑脂截留物或这样的原料的任意组 合，不论原料的FFA(游离脂肪酸）值如何。
[0179] 在包括玻璃反应器形式的反应器容器的处理系统中进行所有转酯/酯化反应实 验，所述反应器可以作为膨胀床、流化床或搅拌槽反应器类型的分批和连续反应器操作，其 中在大体与重力对齐的方向（顶部_底部）上或在大体与重力相对的方向（底部_顶部） 上流经反应器容器。在各种情况中的反应器容器也在机械搅拌条件下操作。反应器容器尺 寸如下：
[0180]内径：10cm ;高度：27cm ;反应体积：2120ml。
[0181] 实施例1
[0182] 在此实施例中，对三种处理系统进行测试，持续时期延长至不少于262天。
[0183] 第一系统（本文的实施例1(a))基于在图2中图解说明的处理系统100'的实施 方式，其中在大体与重力相对的方向（底部_顶部）上流经反应器容器120,并且在通过处 理系统的20ml/min的通过量的流速下操作。
[0184] 第二系统（本文的实施例1(b) (i))充当对照，并且基于类似于图1的系统100的 处理系统，但在大体与重力对齐的方向（顶部-底部）上而不是在大体与重力相对的方向 (底部-顶部）上流经反应器容器，并且在通过各自的处理系统的20ml/min的通过量的流 速下操作。
[0185] 第三系统（本文的实施例1(b) (ii))也充当对照，并且基于类似于第二系统的处 理系统（即，在大体与重力对齐的方向（顶部_底部）上流经反应器容器），并且在通过处 理系统的l〇ml/min的通过量的减小流速下操作。
[0186]实施例1 (a)
[0187] 使用对应于根据本公开主题的第二实施方式的处理系统100'的系统（见图2)，使 用利用甲醇转酯/酯化大豆油或其它原料（不论初始FFA值如何）以形成生物柴油（和甘 油/水），所述系统包括上文提及的玻璃反应器形式的反应器容器120。下文将在实施例中 提及反应系统100'的各种组件。
[0188] 反应条件：
[0189] 参阅图2的系统，包含84g的0. 1M碳酸氢钠溶液和甲醇（125g)的大豆油（1680g) 首先在预反应制备容器140中预混合以形成乳状液，其随后被引入至反应器容器120。反 应混合物与衍生自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶在反应器容器120中在30°C下混合6小时， 所述脂肪酶固定在疏水性且多孔的基于聚苯乙烯-二乙烯基苯的树脂（500g)上。反应混 合物通过上部过滤器125滤出并经由出口 127进料至产物分离容器160。在产物分离容器 160中从反应混合物移出甘油和过量的水。
[0190] 连续模式反应
[0191] 为初始化连续法，首先进行以下步骤。将在较早阶段在容器120中生成的包含脂 肪酸甲酯和任何未反应的甘油酯的上相（upper phase)经由再发送管线重新引入至反应器 容器，并且在向反应器容器中的反应介质内添加甲醇（125g)和84g 0. 1M碳酸氢钠溶液后 在反应器容器中重新开始搅拌。
[0192] 2小时后，至甲酯的转化率为87%。然后如下进行处理系统的连续操作。包含大 豆油（80% wt)、甲醇（15% )和0? 1M碳酸氢钠溶液（5% )的乳化反应介质（制备的乳状 液）在20ml/min的流速下连续进料入反应器容器120。从反应器的上部部分处的出口 127 输出的反应介质经由至反应器容器120的下部部分的进料管线170 (见图2)在100ml/min 的通过流速下再循环至反应器120,同时维持螺旋桨以120rpm搅拌反应混合物。再循环管 线170中的100ml/min的流速足以使酶床膨胀。反应介质的温度被维持在30°C。当使用固 定在大孔疏水性树脂上的衍生自疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的相同批次的生物催化剂时，在 这样的反应条件下，在连续系统中至脂肪酸甲酯的转化率被维持超过3个月，而没有显著 的活性损失。
[0193] 表1第2栏显示了在262日的试验期间的多日内，在上述系统中的原料至脂肪酸 甲酯的转化率。
[0194]实施例
[0195]用于此实施例的系统、反应条件和连续反应操作模式类似于实施例1 (a) -一加以 必要的修正，实施例1(b) (i)中仅有的差异如下：
[0196] -从容器160收集的产物（1680g)与甲醇（125g)和0. lM(84g)的碳酸氢钠溶液混 合。
[0197]-反应介质没有被再循环入反应容器中。
[0198] -然后如下进行处理系统的连续操作。包含大豆油（80% wt)、甲醇（15%)和0. 1M 碳酸氢钠溶液（5% )的乳化反应介质（制备的乳状液）在20ml/min的流速下在反应器的 上部部分处连续进料入反应器容器120,同时维持螺旋桨以120rpm搅拌反应混合物。反应 介质的温度被维持在30°C。当使用固定在大孔疏水性树脂上的衍生自疏棉状嗜热丝孢菌脂 肪酶的相同批次的生物催化剂时，在这样的反应条件下，至脂肪酸甲酯的转化率被维持超 过7个月，而没有显著的活性损失。
[0199] 表1第3栏显示了在262日的试验期间的多日内，在上述系统中的原料至脂肪酸 甲酯的转化率。
[0200]实施例 lb(ii))
[0201] 用于此实施例的系统、反应条件和连续反应操作模式类似于实施例1(b) (i)-一 加以必要的修正，仅有的差异在实施例1(b) (ii)中：包含大豆油（80% wt)、甲醇（15% ) 和0? 1M碳酸氢钠溶液（5% )的乳化反应介质（制备的乳状液）在10ml/min，而不是20ml/ min(由实施例l(b(i))或实施例1(a)提供）的流速下连续进料入反应器容器。
[0202] 表1第4栏显示了在262日的试验期间的多日内，在上述系统中的原料至脂肪酸 甲酯的转化率。
[0203]表1:随时间推移连续混合搅拌和膨胀床反应器中对相同流谏下和减小的流谏下 的对照反应器容器中原料至脂肪酸甲酯的转化率。
[0205] 实施例2
[0206] 使用第一阶段的流出物的第二阶段转酯/酯化反应
[0207] 在此实施例中，对三种处理系统进行测试，持续时期延长至不少于121天。
[0208] 第一系统（本文的实施例2(a))基于在图5的系统200'，其流经反应器容器120 且在辅助反应器容器220中的流动在大体与重力相对的方向（底部-顶部）上，并且在通 过处理系统200'的20ml/min的通过量的流速下操作。
[0209] 第二系统（本文的实施例2(b) (i))充当对照，并且基于类似于图5的系统200' 的处理系统，但流经反应器容器100且在辅助反应器容器220中的流动在大体与重力对齐 的方向（顶部_底部）上，而不是在大体与重力相对的方向（底部_顶部）上，并且在通过 各自的处理系统的20ml/min的通过量的流速下操作。
[0210] 第三系统（本文的实施例2(b) (ii))基于类似于实施例2的第二系统的处理系统 (即，流经反应器容器100且在辅助反应器容器220中的流动在大体与重力对齐的方向（顶 部-底部）上），并且在通过各自的系统的l〇ml/min的通过量的减小的流速下操作。
[0211]实施例 2 (a)
[0212] 使用对应于根据本公开主题的第五实施方式的处理系统200'（见图5)的系统，使 用甲醇转酯/酯化在容器160中分离的流出物的上相的未反应甘油酯和游离脂肪酸以形成 生物柴油甘油/水，所述系统包括上文提及的反应器容器120和辅助反应器容器220,其均 是玻璃反应器的形式。下文将在实施例中提及反应系统200'的多种组件。
[0213] 反应条件：
[0214] 参阅图5的系统，将在分离容器160中分离的来自反应器容器120的流出物的上 相引入至反应器容器220,所述上相由脂肪酸甲酯（超过80% )和包含33. 6g的0. 1M碳酸 氢钠溶液和甲醇（125g)的未反应甘油酯和游离脂肪酸（1680g)组成。反应混合物与衍生 自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶在反应器容器220中在30°C下混合30分钟，所述脂肪酶固定 在疏水性和多孔的基于聚苯乙烯-二乙烯基苯的树脂（500g)上。
[0215] 连续模式反应
[0216] 然后如下进行处理系统的连续操作。如在实施例1 (a)中，制备与7%甲醇和2% 0. 1M的碳酸氢钠溶液混合的、由在分离容器160中获得的获得自反应器容器120的流出物 的上相组成的乳化反应介质（制备的乳状液），并且然后在20ml/min的流速下连续进料至 辅助反应器容器220。从反应器220的上部部分处的出口 227输出的反应介质经由进料管 线270在100ml/min的通过流速下再循环至辅助反应器容器220,至辅助反应器容器220的 下部部分，同时维持螺旋桨以120rpm搅拌反应混合物在120rpm。反应介质的温度被维持在 30°C下。当使用固定在大孔疏水性树脂上的衍生自疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的相同批次的 生物催化剂时，在这样的反应条件下，以连续反应模式至脂肪酸甲酯的转化率被维持超过