用于检测人乳头瘤病毒核酸的组合物和方法
【专利说明】用于检测人乳头瘤病毒核酸的组合物和方法
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求以下申请的优先权的权益：2012年10月11日提交的美国临时申请 No. 61/712, 332,该申请的全部内容据此以引用方式并入本文中。
【背景技术】
[0003] 人乳头瘤病毒（HPV)的感染目标是上皮组织，并且是多种癌症（主要为 鳞状细胞癌和腺癌）的病因。与HPV相关的癌症包括头颈（喉、口腔、口咽、扁桃 体和食道）、呼吸道组织、乳腺、皮肤、宫颈和肛门的癌症。虽然认为HPV感染是一 些癌症发展的必要因素，但其他因素也可能影响癌变过程（Braakhuis et al.，J. Natl. Cancer Inst. 96:998-1006, 2004 (Braakhuis 等人，《美国国立癌症研宄 所杂志》，第 96 卷，第 998-1006 页，2004 年）；Dahlstrand et al.，Anticancer Res. 24:1829-35, 2004 (Dahlstrand 等人，《抗癌研宄》，第 24 卷，第 1829-1835 页，2004 年）； Daling et al.，Cancer 101:270-80,2004(Daling 等人，《癌症》，第 101 卷，第 270-280 页， 2004年）；他6七&1.，0行.1^￥.0四181〇1.]^(1.15:188-96,2004〇^等人，《口腔生物医学 与医学鉴定性评论》，第 15 卷，第 188-196 页，2004 年）；Hafkamp et al.，Acta Otolaryng ol. 124:520-6, 2004 (Hafkamp等人，《耳鼻喉科学报》，第124卷，第520-526页，2004年）； Harwood et al.，Br. J. Dermatol. 150:949-57, 2004 (Harwood 等人，《英国皮肤病学杂志》， 第 150 卷，第 949-957 页，2004 年）；Rees et al.，Clin. Otolaryngol. 29:301-6, 2004 (Rees 等人，《临床耳鼻喉科学》，第29卷，第301-306页，2004年）；Widschwendter et al.，J. Clin. Virol. 31:292-7, 2004 (Widschwendter 等人，《临床病毒学杂志》，第 31 卷，第 292-297 页，2004 年））。
[0004] 已鉴定出至少77种不同类型的HPV。在它们中，HPV16和HPV18在很多情况下 与多种HPV相关癌症有关联，但是与HPV类型相关的风险等级可随乳头瘤相关癌症的不同 形式而变化。已研宄了人乳头瘤病毒在上皮细胞中的发病机理以阐明HPV感染与癌症的 联系。HPV感染复层上皮细胞的基底层细胞，在此处它们以多拷贝附加体或整合基因组的 形式定殖，病毒DNA凭借所述多拷贝附加体或整合基因组随同细胞染色体一起复制（由 Longworth et al.，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68:362-72, 2004 (Longworth 等人，《微生物 学与分子生物学评论》，第68卷，第362-372页，2004年）综述）。在细胞分裂时，子细胞迀 移离开基底层并经历分化，在分化过程中，HPV营养期病毒复制和晚期基因表达被激活，从 而产生子代HPV。虽然被感染个体的免疫系统通常可在1至2年内将HPV感染清除，但被感 染的基底细胞可能存留几十年。HPV感染可导致染色体的不稳定性和非整倍性，这些性质 可有利于 HPV 整合（Melsheimer et al.，Clin. Cancer Res. 10:3059-63, 2004(Melsheimer 等人，《临床癌症研宄》，第10卷，第3059-3063页，2004年）；Reidy et al.，Laryngoscope 114:1906-9, 2004(Reidy 等人，《喉镜》，第 114 卷，第 1906-1909 页，2004 年））。在 HPV 基 因组整合期间，HPV E2基因可能被破坏，导致编码靶向调节蛋白pRb和p53的癌蛋白的 HPV E6/E7致癌基因的表达失调。因此，对细胞调节进行调控的一连串事件可能导致癌变 (Braun et al.，Cancer Lett. 209:37-49, 2004 (Braun等人，《癌症快报》，第 209卷，第 37-49 页，2004 年）；Fan et al.，Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 14:183-202, 2004 (Fan 等人， 《真核状态基因表达评论综述》，第14卷，第183-202页，2004年）；Fiedler et al.，FASEB J. 18:1120-2, 2004(Fiedler等人，《美国实验生物学联合会会刊》，第18卷，第1120-1122 页，2004 年）；Psyrri et al.，Cancer Res. ,64:3079-86, 2004 (Psyrri 等人，《癌症研宄》， 第 64 卷，第 3079-3086 页，2004 年）；Si et al.，J. Clin. Virol. 32:19-23, 2004 (Si 等人， 《临床病毒学杂志》，第32卷，第19-23页，2004年））。
[0005] 由于宫颈癌在世界范围内高发（估计每年有450, 000例新增病例），故HPV感染 与宫颈癌的相关性已成为大量研宄工作和流行病学研宄的课题。与发展成宫颈癌的高风 险相关联的 HPV 类型（HR-HPV)包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 和73型，但各个类型的流行病学意义可随地理区域或临床检验参数不同而变化（Munoz et al.，Int. J. Cancer 111: 278-85, 2004 (Munoz 等人，《国际癌症杂志》，第 111 卷，第 278-285 页，2004 年）；Chaturvedi et al.，J. Med. Virol. 75:105-13, 2005 (Chaturvedi 等人， 《医学病毒学杂志》，第 75 卷，第 105-113 页，2005 年）；5111；[1:116七31.，1111:.]\671^6(3〇1. Obstet. 87:131-7, 2004(Smith等人，《国际妇产科杂志》，第87卷，第131-137页，2004 年））。通常被认为只有较低的发展成宫颈癌的风险的HPV感染（LR-HPV)包括HPV 6、11、 43、43、44、61、71 和 72 型。
[0006] 在感染HPV的妇女中，宫颈感染可能导致湿疣（生殖器疣）、宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)和宫颈癌（Kahn et al.，Adolesc.Med. Clin. 15:301-21，ix，2004(Kahn 等人，《临床 青少年医学》，第15卷，第301-321页，第9章，2004年））。在许多国家中，宫颈细胞的细胞 学检查已成为用于检测宫颈癌的主要筛查工具，其通常使用CIN分级体系（1至3)来监测 癌前病变，以便决定治疗和/或进一步监测。除细胞学筛查外，对HPV核酸进行分子筛查 也许是有可能延长两次细胞学检验之间的时间间隔的经济有效的预后检验手段（Wiley et al.，Curr. Oncol. Rep. 6:497-506, 2004 (Wiley 等人，《当代肿瘤学报告》，第 6 卷，第 497-506 页，2004 年）；Zielinski et al.，Obstet. Gynecol. Surv. 59:543-53, 2004(Zielinski 等人，《妇产科调查》，第59卷，第543-553页，2004年）；Clavel et alJ. Cancer 90:1803-8, 2004(Clavel等人，《英国癌症杂志》，第90卷，第1803-1808页，2004年））。 已经开发出用于检测人类生物样本中的所选择HPV蛋白和核酸序列的分子测定法，例 如巴氏涂片和活组织检查（Chen et al.，Gynecol. Oncol. 99:578-84, 2005 (Chen 等 人，《妇科肿瘤学》，第 99 卷，第 578-584 页，2005 年）；0&1'(?216七&1.，111.1(：1111. Pathol. 124:716-21，2005 (Carozzi等人，《美国临床病理学杂志》，第124卷，第716-721页， 2005 年）；Molden et al.，Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 14:367-72,2005(Molden 等人，《癌症流行病学、生物标记与预防》，第14卷，第367-372页，2005年）；Asato et al.，J. Infect. Dis. 189:1829-32, 2004 (Asato 等人，《传染病学杂志》，第 189 卷，第 1829-1832 页，2004 年）；Federschneider et al.，Am.J. Obstet. Gynecol. 191:757-61 ，2004 (Federschneider等人，《美国妇产科杂志》，第191卷，第757-761页，2004年）； Remmerbach et al.，J. Clin. Virol. 30:302-8, 2004(Remmerbach 等人，《临床病毒学杂志》， 第 30 卷，第 302-308 页，2004 年））。
[0007] 针对常见HPV类型的疫苗对于治疗或预防生殖器疣、或者防止癌症（特别是 宫颈癌）发展可能是有用的。各种形式的HPV疫苗是可用的或正在研制中（Ault et al.，Vaccine 22:3004-7,2004(Ault 等人，《疫苗》，第 22 卷，第 3004-3007 页，2004 年)；Corona Gutierrez et al. , Hum. Genet. Ther. 15:421-31, 2004(Corona Gutierrez 等人，《人类基因治疗》，第15卷，第421-431页，2004年）；Harper et al. , Lancet 364:1757-65, 2004(Harper 等人，《柳叶刀》，第 364卷，第 1757-1765 页，2004年）；Roden et al.，Hum. Pathol. 35:971-82, 2004 (Roden 等人，《人体病理学》，第 35 卷，第 971-982 页，2004 年））。
[0008] 需要有效且灵敏地检测生物样本中HPV的存在，以便向治疗感染HPV的患者（特 别是宫颈组织已感染HR-HPV类型的妇女）的医生提供诊断和预后信息。还需要有效且灵 敏地检测从已接种了抗HPV感染的疫苗的个体获得的生物样本中HPV的存在，以便确定疫 苗的短期和长期疗效。
【发明内容】
[0009] 在一个方面，本发明提供了用于检测疑似含有HPV33的样品中的人乳头瘤病毒33 型（HPV33)靶标核酸的至少两种低聚物的组合。通常，所述低聚物组合包括用于特异性地 扩增与HPV33E6和/或E7基因相对应的HPV33核酸靶标区域的第一扩增低聚物和第二扩 增低聚物。在某些实施例中，（a)第一 HPV33扩增低聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶 标杂交序列为包含在SEQ ID N0:66的序列中的约15至约27个连续核苷酸并至少包括SEQ 10勵:67、5￡〇10勵:68或5￡〇10勵:69的序列；并且〇3)第二册￥33扩增低聚物包含第 二靶标杂交序列，该第二靶标杂交序列为包含在SEQ ID N0:70的序列中的约15至约27个 连续核苷酸并至少包括SEQ ID N0:71、SEQ ID N0:72或SEQ ID N0:73的序列。特别合适 的第一 HPV33扩增低聚物和第二HPV33扩增低聚物包括：（a)包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO: 8的第一靶标杂交序列的第一 HPV33扩增低聚物；以及（b)包含选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16的第二靶标杂交序列的第二HPV33扩增低聚物。在典型的变型形式中，所述 低聚物组合用于检测疑似含有HPV33和至少一种其他HPV基因型（例如，HPV 16、18、31、 45、52和58型中的至少一种）的样品中的HPV33靶标核酸。在一些变型形式中，用于检测 HPV 33和至少一种其他HPV基因型的低聚物组合包括与表4中的两种或更多种低聚物基本 上相同的低聚物的组合。
[0010] 在一些优选的变型形式中，所述低聚物组合还包括用于特异性地扩增与HPV31E6 和/或E7基因相对应的HPV 31型（HPV31)核酸靶标区域的第一扩增低聚物和第二扩增低 聚物。在一些此类实施例中，第一 HPV31扩增低聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶标杂 交序列为包含在SEQ ID N0:74的序列中的约15至约27个连续核苷酸并至少包括SEQ ID N0:75、SEQ ID N0:76或SEQ ID N0:77的序列；并且第二HPV31扩增低聚物包含第二靶标 杂交序列，该第二靶标杂交序列为包含在SEQ ID N0:78的序列中的约15至约30个连续 核苷酸并至少包括SEQ ID N0:79、SEQ ID N0:80或SEQ ID N0:81的序列。特别合适的第 一 HPV31扩增低聚物和第二HPV31扩增低聚物包括：（a)包含选自SEQ ID N0:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID N0:33的第一靶标杂交序列的第一HPV31扩增低聚物；以及（b)包含选自SEQ ID N0:34、 SEQ ID N0:35,SEQ ID N0:36,SEQ ID N0:37,SEQ ID N0:38,SEQ ID N0:39,SEQ ID NO:40 和SEQ ID N0:41的第二靶标杂交序列的第二HPV33扩增低聚物。
[0011] 在一些变型形式中，第二HPV33扩增低聚物为还包含位于靶标杂交序列5'端的启 动子序列的启动子引物或启动子提供者。相似地，在一些还包含HPV31扩增低聚物的实施 例中，第二HPV31扩增低聚物为还包含位于靶标杂交序列5'端的启动子序列的启动子引物 或启动子提供者。合适的启动子序列包括I7RNA聚合酶启动子序列，诸如以SEQ ID N0:82 示出的序列。在更具体的实施例中，第二HPV33扩增低聚物具有以SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 或 SEQ ID N0:24示出的序列；并且/或者第二HPV31扩增低聚物具有以SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:48 或 SEQ ID N0:49示出的序列。
[0012] 低聚物组合还可包括至少一种捕获探针低聚物。例如，所述低聚物组合还可包括 HPV33特异性捕获探针低聚物和/或HPV31特异性捕获探针低聚物。此类HPV33或HPV31 特异性捕获探针低聚物通常包含共价连接到结合于固定化探针的序列或部分的靶标杂交 序列。合适的即￥33靶标杂交序列和即￥31靶标杂交序列分别以3￡〇10勵:50和3￡〇10 N0:52示出。在特定的变型形式中，HPV33捕获探针低聚物或HPV31捕获探针低聚物分别具 有如以SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:53示出的序列。
[0013] 在一些实施例中，低聚物组合还包括至少一种HPV-33特异性检测探针低聚物和/ 或HPV31特异性检测探针低聚物。合适的HPV33检测探针包括包含靶标杂交序列的低聚物， 该靶标杂交序列为约14至约35个核苷酸长并被构造为与包含在SEQ ID N0:83内从约核苷 酸位置128至约核苷酸位置164的靶标序列（例如，选自SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:57和SEQ ID N0:58的靶标杂交序列）特异性杂交。合适的HPV31 检测探针包括包含靶标杂交序列的低聚物，该靶标杂交序列为约14至约40个核苷酸长并 被构造为与包含在SEQ ID N0:84内从约核苷酸位置675至约核苷酸位置735的靶标序列 (例如，选自 SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:63、 SEQ ID N0:64和SEQ ID N0:65的靶标杂交序列）特异性杂交。
[0014] 在其他方面，本发明提供了包含上述低聚物组合的试剂盒或反应混合物。
[0015] 在又一个方面，本发明提供了用于检测样品中的人乳头瘤病毒33型（HPV33)靶标 核酸（例如，HPV33E6/E7mRNA转录物）的方法。该方法通常包括以下步骤：（a)提供疑似 含有HPV33的样品；(b)将该样品与低聚物组合接触，以便特异性地扩增HPV33核酸靶标区 域，所述低聚物组合包括：（i)包含第一靶标杂交序列的第一 HPV33扩增低聚物，该第一靶 标杂交序列为包含在SEQ ID N0:66的序列中的约15至约27个连续核苷酸并至少包括SEQ ID N0:67、SEQ ID N0:68或SEQ ID N0:69的序列，以及（ii)包含第二靶标杂交序列的第二 HPV33扩增低聚物，该第二靶标杂交序列为包含在SEQ ID N0:70的序列中的约15至约27个 连续核苷酸并至少包括3￡〇10勵:71、3￡〇10勵:72或3￡〇10勵 :73的序列；（(：）进行体 外核酸扩增反应，其中存在于所述样品中的任何HPV33靶标核酸均被用作产生HPV33扩增 产物的模板；以及（d)检测HPV33扩增产物存在与否，从而指示样品中是否存在HPV33。特 别合适的第一 33型扩增低聚物和第二33型扩增低聚物包括：(a)包含选自SEQ ID N0:1、 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO: 8的第一靶标杂交序列的第一 HPV33扩增低聚物；以及（b)包含选自SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10,SEQ ID N0:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16的第二靶标杂交序列的第二HPV33扩增低聚物。在该方法的典型变型形式 中，所述低聚物组合用于检测疑似含有HPV33和至少一种其他HPV基因型（例如，HPV 16、 18、31、45、52和58型中的至少一种）的样品中的HPV33靶标核酸。在该方法的一些变型形 式中，还检验了所述样品的HPV 33和至少一种其他HPV基因型，其中在该方法中使用的低 聚物中的两种或更多种与表4中的那些基本上相同。
[0016] 在一些优选的变型形式中，该方法还用于检测样品中的HPV 31型（HPV31)靶标 核酸（例如，HPV31E6/E7mRNA转录物）。在一些此类变型形式中，该方法还包括以下步骤： (b'）将该样品与低聚物组合接触，以便特异性地扩增HPV31核酸靶标区域，所述低聚物组 合包括：（i)包含第一靶标杂交序列的第一 HPV31扩增低聚物，该第一靶标杂交序列为包含 在SEQ ID N0:74的序列中的约15至约27个连续核苷酸并至少包括SEQ ID NO: 75、SEQ ID N0:76或SEQ ID N0:77的序列，以及（ii)包含第二靶标杂交序列的第二HPV31扩增低聚 物，该第二靶标杂交序列为包含在SEQ ID N0:78的序列中的约15至约30个连续核苷酸并 至少包括SEQ ID N0:79、SEQ ID N0:80或SEQ ID N0:81的序列；（c'）进行体外核酸扩增 反应，其中存在于所述样品中的任何HPV31靶标核酸均被用作产生HPV31扩增产物的模板； 以及（d'）检测HPV31扩增产物存在与否，从而指示样品中是否存在HPV31。
[0017] 在方法的一些实施例中，第二HPV33扩增低聚物为还包含位于靶标杂交序列5'端 的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。相似地，在一些还包括对HPV31祀标核酸进 行检测的实施例中，第二HPV31扩增低聚物为还包含位于靶标杂交序列5'端的启动子序列 的启动子引物或启动子提供者。合适的启动子序列包括T7RNA聚合酶启动子序列，诸如以 SEQ ID N0:82示出的序列。在更具体的实施例中，第二HPV33扩增低聚物具有以SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:2U SEQ ID NO:22, SEQ ID N0:23或SEQ ID N0:24示出的序列；并且/或者第二HPV31扩增低聚物具有以SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID N0:48或SEQ ID N0:49示出的序列。
[0018] 在上述的包括对HPV33靶标核酸和HPV31靶标核酸两者进行检测的方法的某些变 型形式中，扩增步骤（c)与扩增步骤（c'）在同一扩增反应混合物中同时进行。通常，在此 类变型形式中，检测步骤（d)与检测步骤（d'）在同一检测反应混合物中同时进行。
[0019] 通常，用于检测HPV33靶标核酸的方法还包括在步骤（b)之前从样品中的其他组 分纯化HPV33靶标核酸。在特定实施例中，所述纯化步骤包括将样品与至少一种HPV33特 异性捕获探针低聚物接触，该HPV33特异性捕获探针低聚物包含共价连接到结合于固定化 探针的序列或部分的靶标杂交序列。特别合适的HPV33靶标杂交序列以SEQ ID N0:50示 出。在更具体的变型形式中，HPV33特异性捕获探针低聚物具有以SEQ ID N0:51示出的序 列。
[0020] 在包括对HPV31靶标核酸进行检测的方法的变型形式中，该方法通常还包括在步 骤（b'）之前从样品中的其他组分纯化HPV31靶标核酸。在特定实施例中，所述纯化步骤包