络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌的制作方法

文档序号:8916251阅读:612来源:国知局
络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水溶性维生素的分离纯化,具体地说就是利用氧化葡萄糖杆菌发酵生产吡咯喹啉醌的后处理方法。
【背景技术】
[0002]吡咯喹啉醌(PQQ)是一种水溶性醌类化合物,广泛存在于食物和动物中,是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶。PQQ已被证明具有很重要的生理功能而被认为是新的B族维生素。已有研宄表明,PQQ可以用于治疗神经性和精神性失调症,这是由于PQQ可以阻止淀粉样蛋白的形成,抑制C-端缩短的变异型突触核蛋白的细胞毒性。并且,PQQ可以有效阻止氧化应激引起的神经退行性病变。总之,PQQ与神经系统相关的功能有如下四种:(1)抗氧化,清除自由基;(2)影响呼吸链功能,维护线粒体能量代谢;(3)刺激神经生长因子的分泌,修复和促进神经生长;(4)延缓a -synuclein蛋白的沉积,防止神经细胞纤维化。因此,有关研宄人员认为PQQ对帕金森病和老年性痴呆等多种神经变性性疾病具有潜在的治疗价值。所以,寻找简单易行的获得PQQ的方法,进行产业化生产,对促进人类的身体健康具有重大的意义。
[0003]化学合成PQQ步骤多,产率低,异构体和副产品的去除需要多步纯化,并需用多种有毒试剂而污染环境(JACS,1981 ;103:5599_2600)。因此,一般认为生物学合成方法更具产业化意义。PQQ广泛存在于革兰阴性菌中,但合成量却有所不同,有些菌只产生痕量PQQ,供正常的生理代谢需求,如恶臭假单胞菌;还有些菌却能产生过量的PQQ,并分泌到胞外。迄今发现的能产生过量PQQ的野生菌包括氧化葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、弯杆菌属(Ancylobacter)、生丝微菌属(Hyphomicro- bium)、甲烧单胞菌属(Methanomonas)、甲基菌属(Methy-lobacillus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、嗜甲基菌属(Methy-lophiIus)、硫杆菌属(Th1bacillus)及黄色杆菌属(Xanthobacter)等。目前,也有采用微生物发酵的方法生产PQQ,使用的原始菌种PQQ产量在0.07-7mg/L,发酵时间为2-5天左右(US Pat49943)。根据文献调研,目前并没有发现简单易行的从微生物发酵液中制备PQQ的方法,而实现PQQ的工业规模生产。
[0004]萃取过程以其分离效率高、生产能力大,便于快速连续和安全操作以及能耗低等优点而被广泛研宄。而我们注意到PQQ的结构中包含3个羧基,显色酸性。根据这个结构特点,可以利用络合萃取法对其进行分离纯化。络合萃取是基于可逆络合反应的原理,溶液中待分离溶质与含有络合剂的萃取剂接触,络合剂与待分离溶质反应形成络合物,并使其转移至萃取相内。然后,根据摆动效应,进行反萃,溶质得以回收,萃取剂循环使用。因此,络合萃取法具有高效性、高选择性和成本低的优点,可以用于PQQ生产后的分离纯化。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是克服现有技术不足,提供一种大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌的方法。
[0006]本发明的技术方案如下:络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌,它的步骤如下:
(1)将菌种发酵,得到发酵液;
(2)发酵液经高速离心,将上清液在双溶质萃取体系进行络合萃取,其中三辛胺为络合剂,正己烷为稀释剂,得到富含吡咯喹啉醌的上层液;
(3)将富含吡咯喹啉醌的上层液用氨水反萃,氨水层减压浓缩后,冷冻干燥,得到吡咯P奎琳醒粗品;
(4)将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解,用HCL将pH调至3~4后,加入乙醇,在20~25°C下搅拌5~6 h,然后静置12-24 h,得到吡咯喹啉醌。
[0007]所述步骤(2)中双溶质萃取体系中三辛胺与正己烷的体积比为萃取体系与发酵液的体积比为1:1~3: 1,萃取次数为3~5次。
[0008]所述步骤(3)中氨水的浓度为1%~3%,萃取次数为3~5次,氨水与富含吡咯喹啉醌的上层液的体积比为1:1~3:1。
[0009]所述步骤(4)中将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解后浓度为9g/L~12g/L,超纯水与乙醇体积比为3:1~5:1。
[0010]本发明的有益效果是:本发明利用上述生产制备方法,条件简单,过程快捷,便于大规模工业化生产,对促进PQQ的产业化有重要意义。
【附图说明】
[0011 ] 图1为UPLC-DAD法在249nm下检测萃取液中PQQ ;
图2为结晶产物的HPLC分析结果;
图3为PQQ产物的紫外光谱,其中,A为对照品,B为样品;
图4为PQQ产物的质谱。
【具体实施方式】
[0012]络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌,它的步骤如下:
(1)氧化葡萄糖杆菌的发酵:将菌种按照5%的比例接入发酵培养基(每升含有40g山梨醇、20 g 酵母提取物、5 g (NH4)2SO4,2 g KH2PO4,5 g MgSO4.H2O)中,在 28°C下震荡培养3d。发酵罐培养时按照10%接种,培养基浓度为正常2倍。将菌种接种至富集培养基,28°C下震荡培养5d,培养物5°C 9000r/min离心15分钟,得到含有PQQ的上清液;
(2)富集:将发酵液高速离心,取上清液,以双溶质萃取体系进行络合萃取,其中三辛胺为络合剂,正己烷为稀释剂,两者体积比为1:1~3:1,萃取体系与发酵液的体积比为
重复萃取3~5次。分离上面有机层,即得到富含吡咯喹啉醌的部位;
(3)反萃:将上述富含吡咯喹啉醌的部位用浓度为1。/『3%的氨水反萃3~4次,每次萃取时氨水与有机相的体积比为氨水层减压浓缩后,将其冷冻干燥,即得PQQ粗品;
(4)重结晶:将PQQ粗品用超纯水溶解,浓度为9g/L~12 g/L。用HCL将其pH值调至3-4后,加入体积比为3:1~5:1的乙醇,有红色固体析出。将悬浮液在20~25°C下搅拌5~6ho然后静置24 h,即可得到PQQ的晶体;
(5)产物分析: 产物的HPLC检测:采用Waters Symmetry 300 C18反向色谱柱,以乙腈:水(乙腈和水均含2%甲酸)为流动相,流速lml/min,梯度洗脱(30-90%,30min),检测波长249nm,可以得到较好的色谱分析结果。结果表明,产物为纯度达到99%以上的PQQ样品;
产物质谱数据:通过与文献报道PQQ质谱数据对比,结果表明,样品与其完全一致。
[0013]实施例1
络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌,它的步骤如下:
(1)将氧化葡
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