一种对t细胞和造血干细胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于构建具有高效转 染能力和表达高效生物活性的慢病毒载体方法。
【背景技术】
[0002] 随着生物技术的发展，基因工程（genetic engineering)在医学上的应用越来越 广泛。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变 生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的技术。基因工程技术为基因的结构和功能 的研宄提供了有力的手段。
[0003] 对于哺乳动物细胞的遗传改造，需要使用合适的载体，将外源基因导入宿主细胞 中并实现其应有的功能。常用的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体以及逆转录病毒载体等。 但是，仍然存在着感染效率低、实验流程复杂的问题。因此，本领域技术人员致力于开发新 的感染效率高，且生物活性强的哺乳动物细胞遗传改造技术。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于构建具有高效转染能力和表达高效生物活性的 慢病毒载体方法及其应用。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种重组病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所示的 结构：
[0006] N 端' B-A C 端'（I)
[0007] 其中，
[0008] 元件A为衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
[0009] 元件B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别细胞膜表面蛋白；
[0010] 表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
[0011] 在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。
[0012] 在另一优选例中，所述慢病毒为水疱口炎病毒。
[0013] 在另一优选例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白为水疱口炎病毒包膜糖蛋白。
[0014] 在另一优选例中，所述元件A为VSVG (水疱口炎病毒糖蛋白）。
[0015] 在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，优选地，所述元 件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0016] 在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于T细胞细胞膜表面的蛋白；优选 地，所述细胞膜表面蛋白选自：VLA-4、VLA-5、或其组合。
[0017] 在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于造血干细胞细胞细胞膜表面的蛋 白。
[0018] 在另一优选例中，所述元件B衍生自纤连蛋白、VCAM-I或其活性片段（能够与 VLA-4和/或VLA-5特异性结合的多肽片段）。
[0019] 在另一优选例中，所述元件B选自：FN-P及其活性片段、CSl及其活性片段、或其组 合。
[0020] 在另一优选例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所示。
[0021] 在另一优选例中，所述元件B的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、或SEQ ID NO. : 5所示。
[0022] 在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白选自下组：
[0023] (i)具有SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列的多肽；
[0024] (ii)具有与SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡
[0025] 90 %的同源性；等优选地彡95 %的同源性；最优选地，彡97 %的同源性，
[0026] 如98%以上，99%以上）的多肽，且所述多肽具有与⑷中多肽相似的活
[0027] 性；
[0028] (iii)将（i)中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或
[0029] 添加而形成的，且保留（i)中多肽活性的衍生多肽。
[0030] 在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白具有选自下组的一个或多个特性：
[0031] a)具有特异性识别细胞膜表面蛋白的活性；
[0032] b)具有促进T细胞增殖的活性。
[0033] 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第 一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。
[0034] 本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0035] 在另一优选例中，所述载体中含有编码式I所示结构的融合蛋白的多核苷酸序 列，
[0036] B-A (I)
[0037] 其中，
[0038] A为VSVG (水疱口炎病毒糖蛋白）蛋白元件；
[0039] B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别细胞膜表面蛋白；
[0040] 表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
[0041] 在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，优选地，所述元 件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0042] 在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于T细胞细胞膜表面的蛋白；优选 地，所述细胞膜表面蛋白选自：VLA-4、VLA-5、或其组合。
[0043] 在另一优选例中，所述元件B衍生自纤连蛋白或VCAM-1。
[0044] 在另一优选例中，所述元件B选自：FN-p及其活性片段、CSl及其活性片段、或其组 合。
[0045] 在另一优选例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所 不O
[0046] 在另一优选例中，所述元件B的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、SEQ ID NO. : 5 所示。
[0047] 在另一优选例中，所述载体为质粒。
[0048] 在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体、腺病毒载体、或腺病毒相关载体。
[0049] 本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的重组病毒，所述病毒具有本发明第 一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。
[0050] 在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。
[0051] 在另一优选例中，所述病毒的基因组中具有外源基因。
[0052] 在另一优选例中，所述外源基因包括表达CAR(嵌合抗原受体）的外源基因。
[0053] 在另一优选例中，所述病毒具有至少两种权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白 (优选为具有相同的元件A和不同的元件B)。
[0054] 在另一优选例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO: 19、和SEQ ID NO. :21 所示的氨基酸序列的多肽。
[0055] 本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或 基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0056] 在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞（如CHO细胞、NSO细胞、 或293细胞）。
[0057] 本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的重组病毒包膜糖蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本 发明第四方面所述的重组病毒、和/或本发明第五方面所述的宿主细胞。
[0058] 在另一优选例中，所述试剂盒中包括编码本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖 蛋白的载体；和，野生型载体，所述野生型载体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野 生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0059] 在另一优选例中，所述试剂盒中包括本发明第四方面所述的重组病毒。
[0060] 本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白、本发明 第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包 装。
[0061] 本发明的第八方面，提供了一种重组病毒的包装方法，所述方法包括步骤：
[0062] (1)提供一包装细胞；
[0063] (2)配制转染体系，所述转染体系中包括表达本发明第一方面所述的重组病毒包 月吴糖蛋白的载体；和
[0064] (3)转染包装细胞，进行病毒包装。
[0065] 在另一优选例中，所述步骤（2)中，所述转染体系包括至少两种表达不同的重组 病毒包膜糖蛋白的重组型载体；优选地，所述转染体系中还包括野生型载体，所述野生型载 体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0066] 在另一优选例中，所述重组型载体为FN-p-VSVG，和/或CSl-VSVG ;所述野生型载 体为野生型载体H2。
[0067] 在另一优选例中，所述步骤（2)所述转染体系中包括重组型载体
[0068] FN-p-VSVG，和CSl-VSVG ;以及野生型载体H2 ;优选地，所述重组型载体
[0069] (FN-p-VSVG和CSl-VSVG之和）与所述野生型载体的数量比为7 :3-6。
[0070] 在另一优选例中，所述重组型载体中FN-p-VSVG !CSl-VSVG为1 :1。
[0071] 在另一优选例中，所述包装细胞为HEK-293T细胞。
[0072] 本发明的第九方面，提供了本发明第四方面所述的重组病毒的用途，用于制备生 产CAR-T细胞的试剂。
[0073] 本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第四方面所述的重组 病毒和任选的赋形剂。
[0074] 在另一优选例中，所述的制剂为药物制剂。
[0075] 在另一优选例中，所述的赋形剂为药学上可接受的赋形剂。
[0076] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0077] 图1显示了野生型H2质粒的结构图谱。
[0078] 图2显示了经重组的FN-p - VSVG质粒的结构图谱。
[0079] 图3显示了经重组的CSl-VSVG质粒的结构图谱。
[0080] 图4中A图显示了转染体系中不同类型H2质粒配比对病毒产量的影响，B图显示 了成功表达的病毒颗粒的免疫印迹检测结果。
[0081] 图5显示了本发明中经改造的慢病毒对T细胞的感染效率的检测结果。
[0082] 图6显示了本发明中经改造的慢病毒能够显著的促进T细胞扩增。
[0083] 图7显示了本发明中经改造的慢病毒对不同类型的细胞均表现出了较高的感染 效率效率。
【具体实施方式】
[0084] 本发明人通过广泛而深入的研宄，获得一种能够高效转染哺乳动物细胞的技术， 实验结果表明，该技术能够提高病毒感染效率达30-70%，而且发明人意外地发现，使用本 发明的技术方案还能够有效刺激T细胞的增殖，进而简化CAR-T细胞治疗的流程，降低成 本。
[0085] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这 类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并 且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0086] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语 "约"意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述"约100"包括99 和101和之间的全部值（例如，99. 1、99· 2、99· 3、99· 4等）。
[0087] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法 和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0088] 具体地，本发明涉及一种新型的慢病毒包膜质粒，可应用于慢病毒的包装及哺乳 动物细胞的感染实验，包括CAR-T细胞治疗T细胞活化及感染实验。目前常规实验所使用 的慢病毒都是使用VSVG作为包膜糖蛋白的，但是该型包膜糖蛋白的慢病毒在感染一些难 感染的哺乳动物细胞时，效率较低。本发明中通过重组人纤连蛋白的细胞结合域或CSl功 能域，与VSVG融合表达，从而使新型的慢病毒获得特异性靶向VLA-5、VLA-4抗原的能力，进 一步提高病毒感染效率。同时，重组的纤连蛋白还能刺激T淋巴细胞的增殖。在CAR-T细 胞治疗T细胞活化阶段，使用该新型慢病毒可在活化T细胞的同时即转入外源基因，简化实 验流程，降低成本。而普通的慢病毒并无此功能。
[0089] 将纤连蛋白的细胞识别域与CSl功能域分别与慢病毒的包膜质粒H2的VSVG基因 融合表达，与载体质粒、辅助质粒Hl共转染293T细胞，从而得到可靶向细胞表面的VLA-4、 VLA-5抗原的新型慢病毒颗粒。与传统方法相比，可极大提高慢病毒感染哺乳动物细胞的效 率（可达30-70% )，此外还能促使T淋巴细胞成千上万倍的增殖。
[0090] VSVG
[0091] 在本发明中，术语VSVG指水疱性口炎病毒糖蛋白，在本发明的一个优选的实施方 式中，所述VSVG的氨基酸序列如下：
[0092] MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNffKNVPSNYHYCPSSSDLNffHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQ ADG