一株肠膜明串珠菌及其在低温青贮中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株肠膜明串珠菌及其在低温青贮中的应用。
【背景技术】
[0002] 青贮是在乳酸菌的厌氧发酵作用下将碳水化合物转化为有机酸，从而使pH降低 达到长期贮存的目的。乳酸菌和温度是青贮饲料发酵品质好坏的决定性因素。
[0003] 燕麦是高寒地区冬春饲补的主要饲料作物，由于高寒地区温度低海拔高，不利于 乳酸菌的生长，很难发酵出品质优良并可以长期贮存的饲料。
[0004] 因此，筛选出耐高低温、耐盐、耐酸碱的抗逆性较强的菌株，并将其作为发酵剂添 加到低温青贮燕麦饲料中，将会对高寒地区的青贮饲料制作有着巨大的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株肠膜明串珠菌。
[0006] 本发明所提供的肠膜明串珠菌具体为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_605,该菌株已于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中 心），其保藏编号为CCTCC NO :M 2015254。
[0007] 所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_605从中国青海省青海湖 鸟岛湿地芦苇上分离得到的，该菌株单菌落为圆形状，革兰氏染色呈阳性，不产过氧化氢， 不能发酵葡萄糖产气，发酵类型为同型发酵。在5°C和KTC均长势良好，45°C以上不能存 活，表明该菌株有良好的耐低温性，耐高温性较差；在3. 0 %的NaCl培养基中长势良好，有 一定的耐盐性；在PH3. 5-9的培养环境中生长均良好，表明耐酸碱性能较好。表明该菌株的 生长适应能力很强，可耐极端环境存活繁殖。可耐极端环境存活繁殖。其16S rDNA序列如 序列表中序列1所示。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
[0009] 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-605CCTCC NO ：M 2015254〇
[0010] 所述菌剂除了包含作为活性成的所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-605CCTCC Ν0:Μ 2015254外，还可包含辅料，如MRS固体培养基（溶剂 为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合 乙酸钠5g/L，吐温80 lg/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/ L，琼脂 17g/L)。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种青贮饲料添加剂。
[0012] 本发明所提供的青贮饲料添加剂的活性成分为所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-605CCTCC NO ：M 2015254〇
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种青贮饲料。
[0014] 本发明所提供的青贮饲料中含有所述青贮饲料添加剂。
[0015] 所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-605CCTCC NO :M 2015254 或所述菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0016] (al)抑制细菌；
[0017] (a2)制备细菌抑制剂；
[0018] (a3)制备所述青贮饲料添加剂；
[0019] (a4)制备所述青贮饲料。
[0020] 所述（al)的应用为非疾病诊断或治疗的应用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体可为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。
[0022] 其中，所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides) QH1-605CCTCC NO : M2015254或所述菌剂对所述细菌的抑制具体体现为30°C条件下的抑制。
[0023] 所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的第五个目的是提供一种制备所述青贮饲料的方法。
[0025] 本发明所提供的制备所述青贮饲料的方法，具体可包括：将青贮原料与所述肠膜 明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_605CCTCC NO :M 2015254混合，进行厌氧固体 发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料；
[0026] 在本发明中，所述青贮原料为燕麦全株；具体为乳熟期燕麦全株，水分含量 82. 97%，切割成l-2cm小段。。
[0027] 在所述方法中，所述燕麦全株和所述肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides) QH1-605CCTCC NO :M 2015254 的配比可为 100g : IO5Cfu ;所述发酵为低温 发酵；所述低温可为5°C ;所述发酵的时间可为30天。
[0028] 本发明所提供的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-605CCTCC NO : M 2015254具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮（5°C )过程中迅速繁殖并产 酸降PH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保 留，非营养物质如粗灰分成分降低，达到长期保存青贮饲料的效果。
[0029] 保藏说明
[0030] 菌种名称：肠膜明串珠菌
[0031] 拉丁名：（Leuconostoc mesenteroides)
[0032] 菌株编号：QH1-605
[0033] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0034] 保藏机构简称：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登记入册编号：CCTCC NO :M 2015254
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-605的分离与鉴定
[0041] 一、菌株QH1-605的分尚与筛选
[0042] 取中国青海省青海湖鸟岛湿地芦苇10g，放入90mL无菌水，震荡10秒，吸取ImL液 体放于I. 5mL离心管，依次稀释101，103, IO5倍，取稀释液体20 μ L分别涂布到MRS固体培 养基上，30°C厌氧培养48小时，取单菌落MRS琼脂培养基扩大培养，将获得的其中一株菌编 号为 QH1-605。
[0043] 其中，所述MRS固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温80 lg/L，磷酸氢二钾2g/L，梓 檬酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-605的鉴定
[0045] 从以下几个方面对步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-605进行鉴定。
[0046] 1、形态学鉴定
[0047] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-605,革兰氏染色后，显微镜下观察单菌落形状 呈圆形状。
[0048] 2、生理生化特征鉴定
[0049] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-605为革兰氏染色阳性，不产过氧化氢，不能 发酵葡萄糖产气，发酵类型为同型发酵。
[0050] 利用API 50CH检测菌株QH1-605对不同碳源的发酵利用情况。结果如表1所 示。可见，菌株QH1-605不能发酵利用甘油，D-阿拉伯糖，D-木糖，鼠李糖，甘露糖，山梨醇， α -甲基-D-甘露糖，熊果苷，α -甲基-D-葡糖苷，D-松二糖，蔗糖，蜜二糖，乳糖，N-乙酰 葡糖胺，松三糖，棉子糖，淀粉，糖原，5-酮基-葡糖酸盐，D-塔格糖，L-海藻糖，葡糖酸盐，赤 藓糖醇，L-木糖，核糖醇，β-甲基木糖苷，半乳糖醇，纤维糖，菊糖，木糖醇，D-来苏糖，D-海 藻糖，D-阿拉伯醇，L-阿拉伯醇，果糖，山梨糖，葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，2-酮基-葡糖酸盐 做碳源；可以发酵利用核糖，L-阿拉伯糖，半乳糖，苦杏仁苷，七叶灵，纤维二糖，水杨苷，海 藻糖做碳源；可以微弱利用龙胆二糖作为碳源进行发酵。
[0051] 表1菌株QH1-605对不同碳源的发酵利用情况
[0052]
[0053] 注：" + "表示阳性，即能利用；表示阴性，即不能利用；"w"表示弱阳性，即微弱 利用。
[0054] 3、16S rDNA序列同源性分析
[0055] 提取步骤一所得的菌株QH1-605的基因组DNA，以其为模板，采用细菌通用引物进 行PCR扩增，获得菌株QH1-605的16S rDNA片段，并进行序列测定，其序列为序列表中序 列 1。将序列 1 在 G