Hsv-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HSV-I病毒体外基因敲除系统及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 基因敲除技术广义的定义是将生物细胞基因组某基因去除或使基因失去活性的 技术，包括将某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组 序列的敲除。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段， 从而达到基因敲出的目的。
[0003] 目前病毒基因敲除的方法基本上都是抗性基因替换法，即用一段编码抗性基因的 外源片段，通过同源重组替换病毒基因组内的目的基因，然后通过空斑纯化的方法进行病 毒的筛选，获得突变病毒株。但利用此方法进行基因敲除成功率太低，空斑纯化过程非常耗 时耗力，并且由于直接涉及到活病毒操作，还给实验带来一定的危险性。因此如果开发出一 套更加高效简便的体外病毒基因敲除的方法，毫无疑问会得到广泛的应用，促进对HSV病 毒各基因功能的研宄。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中病毒基因敲除方法周期长、成功率低、空斑纯化工作量大， 且涉及到活病毒操作，存在潜在的危险性等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种 HSV-I病毒体外基因敲除系统，该系统用于体外病毒基因敲除高效、简便。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述基因敲除系统的制备方法。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述基因敲除系统的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] -种HSV-I病毒体外基因敲除系统，为含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的 细菌细胞；
[0009] 所述的BAC-HSV-I载体为载有HSV-I病毒全基因组的细菌人工染色体；
[0010] 所述的PREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的载体；
[0011] 所述的阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点可分别诱导Cre-recombinase重组 酶和重组限制性内切酶I-SecI的表达；
[0012] 所述的重组限制性内切酶I-SecI可识别I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过 程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤；
[0013] 所述的细菌细胞优选为EPI300E. Coli细菌；
[0014] 所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的pKD46载 体；
[0015] 所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统的制备方法，包含如下步骤：
[0016] (I) pREDI重组载体的构建：
[0017] ①根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到启动子 PrhaB编码基因的DNA片段；
[0018] ②根据重组限制性内切酶Ι-sceI编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增 得到重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段；
[0019] ③通过重组PCR连接步骤①扩增得到的启动子PrhaB编码基因的DNA片段和步骤 ②扩增得到的重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段，获得PrhaB-I-SecI片段；
[0020] ④将 PrhaB-I-SecI 片段和 pKD46 λ -red recombinase 载体连接，获得 pREDI 重组 载体；
[0021] (2)含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的细菌细胞的构建：
[0022] 将步骤（1)制备得到的pREDI重组载体转入含有BAC-HSV-I载体的细菌细胞中， 获得含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的细菌细胞，即为HSV-I病毒体外基因敲除系 统；
[0023] 步骤⑴①中所述的PCR扩增引物优选为：
[0024] PrhaB-F : 5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3' ；
[0025] PrhaB-R : 5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3' ；
[0026] 步骤⑴②中所述的PCR扩增引物优选为：
[0027] I-SceI-F :5,-TTA GAC TGG TCG TAA TGA AAT TCA GCA GGA TCA CAT CTG GGT C-3，；
[0028] I-SceI-R :5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA MG TTT CGG AGG AGA TAG TG-3，；
[0029] 步骤（I)③所述的重组PCR的扩增引物优选为：
[0030] PrhaB-F : 5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3' ；
[0031] I-SceI-R ：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA MG TTT CGG AGG AGA TAG TG-3，；
[0032] 步骤（2)中所述的BAC-HSV-I细菌细胞优选为载有HSV-I病毒1737株全基因组 的细菌人工染色体（BAC-HSV-1-1737载体）的细菌细胞；
[0033] 所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用；
[0034] 所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应用，包含如下步 骤：
[0035] (1)通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段：
[0036] ①分别通过PCR扩增获得的靶基因上下游同源片段A-C段、正向筛选标记基因 Ml 片段、反向筛选标记基因 M2-B片段；
[0037] ②通过重组PCR将正向筛选标记基因 Ml片段和反向筛选标记基因 M2-B片段连 接，获得标记基因 Ml-标记基因 M2-B片段，标记基因 Ml片段与标记基因 M2-B片段中间含 有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
[0038] ③再次通过重组PCR将标记基因 Ml-标记基因 M2-B片段与A-C段相互连接，获得 A-C-标记基因 Ml-标记基因 M2-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段；
[0039] (2) HSV-I靶基因敲除：
[0040] 将步骤⑴制备得到的靶基因敲除同源重组片段转化到HSV-I病毒体外基因敲除 系统中，经过诱导剂阿拉伯糖和鼠李糖分别诱导相关蛋白酶的表达，进行基因的重组及筛 选抗性基因的去除，得到完全敲除缺失靶基因的BAC-HSV-I ;
[0041] 步骤（1)中所述的靶基因上下游同源片段A-C段长0.6~1.0 kb，为长20~SObp 的靶基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同 源片段C上游；
[0042] 步骤（1)中所述的反向筛选标记基因 M2-B片段为反向筛选标记基因 M2片段与长 20~SObp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，标记基因 M2片段位于同源片段B 上游；
[0043] 所述的通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段，优选通过如下步骤进行（图 1)：
[0044] ①分别通过PCR扩增获得长0. 7~0. 9kb的靶基因上下游同源片段A-C段、长 I. 0~I. 2kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因 Kanr片段、长1. 9~2. Ikb的反向筛 选标记基因 SacB-B片段；
[0045] ②通过重组PCR将Kanr片段与SacB-B片段连接，获得长2. 9~3. 3kb的 Kanr-SacB-B片段，Kanr与SacB-B中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点；
[0046] ③再次通过重组PCR将Kanr-SacB-B片段与A-C段相互连接，获得长3. 6~4. 2kb 的A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段；
[0047] 所述的靶基因上下游同源片段A-C段为长20~60bp的靶基因上游同源片段A与 靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游；
[0048] 所述的反向筛选标记基因 SacB-B片段为SacB基因片段与长20~60bp的靶基因 末端同源片段B通过PCR连接，其中，SacB基因片段位于同源片段B上游；
[0049] 所述的靶基因优选为HSV-I病毒UL18基因；
[0050] 本发明的原理：本发明中利用携带有HSV-I病毒全基因组的BAC载体和pREDI重 组载体，将这两种载体转化至同一细菌细胞内，构建成一个体外重组系统。其中，PREDI重 组载体含有两个可诱导位点：阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点，阿拉伯糖诱导位点可 在阿拉伯糖的诱导下表达Cre-recombinase重组酶，同时鼠李糖诱导位点可在鼠李糖的诱 导下表达重组限制性内切酶I-SecI。重组限制性内切酶I-SecI识别两个筛选标记基因之 间的I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤。
[0051] 本发明构建了预敲除的HSV-I病毒靶基因同源片段，在该同源片段中含有两个 筛选标记基因（如：Kanr基因和SacB基因），三个靶基因上下游的同源序列A、B、C，以及 I-SceI识别位点，然后将该靶基因敲除同源重组片段（A-C-Kanr-I-SceI-SacB-B)转化到 上述的体外重组系统内。
[0052] 重组限制性内切酶I-SecI识别Kanr和SacB片段之间的I-SecI识别位点，并在 此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤。宿主细胞内存在的DNA损伤 修复系统会识别DNA双链的断裂，并通过诱导损伤部位附近同源片段的重组进行DNA损伤 的修見。即在A祀基因上'游 -C祀基因下'游-Kanr-SacB-B(祀基因)片段的C片段与革巴基因基因下游片段 之间进行同源重组。通过SacB反向筛选标记基因对正确去除标记基因的细菌进行筛选，获 得完全去除标记基因的靶基因敲除菌株，通过PCR对挑选的克隆进行鉴定。
[0053] 本发明将带有HSV-I病毒基因组的BAC-HSV-1-1737载体和pREDI质粒采用转化 的方式导入到同一细菌细胞内，再利用电转化的方式将靶基因同源片段-Cigsht 游-Kanr-SacB-B( ^sh >)导入到含有两个质粒的细菌细胞内，经过阿拉伯糖的诱导，诱导重 组酶的表达，实现靶基因与同源序列片段在靶基因的上下游进行重组替换。重组发生后再 经过鼠李糖诱导I-SceI内切酶的表达，将重组到HSV-I基因组靶基因内的筛选标记基因去 除，从而得到敲除靶基因的BAC-HSV-1-1737缺陷菌株（图2)。
[0054] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0055] (1)利用此基因敲除系统可以在很短的时间内（最快3周左右）完成病毒基因的 敲除工作，敲除的周期极短，且成功率高。
[0056] (2)利用此系统进行基因敲除不会在基因组内掺入任何外源的DNA片段，是完完 整整的基因敲除，而不是靶基因的取代，从而可以完全避免外源筛选标记基因对病毒基因 组的影响，使得到的结果更加可信。
[0057] (3)利用此系统进行基因敲除，由于是体外操作，所以免去了重