一型硫氧还蛋白在内皮祖细胞的培养中的应用及内皮祖细胞的培养方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一型硫氧还蛋白在内皮祖细胞的培养中的应 用及内皮祖细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前，构建组织工程化血管所用内皮种子细胞多是从成年动物或人体大血管消化 得到的成熟内皮细胞，这不仅造成新的机体创伤，而且该来源的内皮细胞在体外培养过程 中，细胞扩增量和细胞活性均不理想，很难达到预期的效果。因此急需一种增殖能力和活性 俱佳的血管内皮细胞来作为种子细胞。
[0003] 内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs)，是血管内皮细胞的前体细 胞，是⑶34阳性细胞的一个亚群。1997年有文献报道在体外成功地将⑶34阳性细胞诱导 成血管内皮细胞，说明在成人体内存在内皮祖细胞。后有多篇报道证实，由EPCs分化而来 的内皮细胞能够参与实体肿瘤血管化，心肌局部缺血以及肢体局部缺血侧枝循环的建立。 因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的一个新来源。
[0004] 然而，现有技术对EPCs的培养效果大多不甚理想，普遍存在着一些问题导致EPCs 无法再体外稳定的增殖，例如：增殖天数有限（通常在12天内）、传代次数有限（通常在P6 代以内）、增殖倍数不高（通常在50倍以下）、容易老化（细胞培养时间越长，细胞表面标 志物⑶34+、VEGFR-2(也可写成⑶309) +表达就越低）；同时批间差较大，不同人来源的标 本培养出的内皮祖细胞数量差异较大，无法稳定生产；上述这些问题都导致了 EPCs无法稳 定的生产，进而导致无法在临床上很好的应用EPCs。
[0005] 导致EPCs增殖效果不佳的问题主要在于培养液的配方，传统配方中为了维持 EPCs的活性通常需要加入胎牛血清，然而异源血清的加入提高了人体发生排异反应的风 险，并且，异源血清虽然营养丰富，但是对细胞活性的维持效果其实十分有限，无法达到临 床对EPCs培养效果的需求。
[0006] 硫氧还蛋白是一类在细胞内具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，具有抗氧化 并促进血管生成的作用，但其在体外的活性尚未得到证实。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一型硫氧还蛋白在内皮祖细胞的培 养中的应用及内皮祖细胞的培养方法，本发明通过实验证明，一型硫氧还蛋白的加入能够 提高EPCs的增殖倍数，延长细胞培养的时间，延缓EPCs的衰老，且成本较低。
[0008] 本发明提供了一型硫氧还蛋白在延缓内皮祖细胞衰老、提高内皮祖细胞增殖效率 中的应用。
[0009] 硫氧还蛋白是细胞内可溶性、对热稳定、具有氧还原活性的酸性小分子蛋白质，一 型硫氧还蛋白位于细胞浆和细胞核中，包含108个氨基酸残基。现有技术表明，一型硫氧还 蛋白在多种刺激特别是氧化应激条件下可诱导表达，提示一型硫氧还蛋白是细胞抵抗氧化 应激的重要分子，能够保护组织或细胞免受多种刺激的损伤。且一型硫氧还蛋白在炎性病 变组织中高表达、具有抗氧化、抗凋亡、类趋化因子细胞因子活性，能够调苄基因表达，保护 再灌注损伤、调节蛋白质的亚硝基化。
[0010] 本发明提供的实验证实，在培养液中添加一型硫氧还蛋白培养EPCs，细胞传代7 代仍保持旺盛的生长和良好的活力，传代7代细胞增殖1686倍，细胞传代10代，表面标志 物⑶309的表达量为98 %，干细胞特性保持良好。以上实验结果说明，一型硫氧还蛋白能够 提高EPCs的增殖倍数，延长细胞培养的时间，延缓EPCs的衰老。
[0011] 本发明还提供了一种内皮祖细胞培养液，包括基础培养液、人类转化因子、干细胞 生长因子、丙酮酸钠、胰岛素、牛血清白蛋白、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和一 型硫氧还蛋白。
[0012] 在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12培养液。
[0013] 在本发明的实施例中，人类转化因子、干细胞生长因子、胰岛素、牛血清白蛋白、 碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和一型硫氧还蛋白的质量比为15 :15 :15000 : 40000 :20 :20 : (10 ~40)。
[0014] 在一些实施例中，人类转化因子、干细胞生长因子、胰岛素、牛血清白蛋白、碱性成 纤维生长因子、血管内皮生长因子和一型硫氧还蛋白的质量比为15 :15 :15000 :40000 :20 : 20 ：40〇
[0015] 在一些实施例中，一型硫氧还蛋白的浓度为10ng/mL~40ng/mL。
[0016] 优选的，一型硫氧还蛋白的浓度为40ng/mL
[0017] 在一些实施例中，丙酮酸钠的浓度为20 μ mol/mL。
[0018] 人类转化因子（TGF-β)是一多功能蛋白质，能够影响细胞生长、分化、凋亡及免 疫调节。干细胞生长因子（Stem Cell Growth Factors)为一种具有刺激自体内源性干细 胞生长的高效蛋白质、酶组合，也是体外培养干细胞必不可少的各种细胞生长因子的组合， 富含表皮生长因子（EGF)、纤维细胞生长因子（FGF)、神经生长因子（NGF)、肝细胞生长因 子（HGF)、脑源性神经营养因子（BDNF)、血小板源性生长因子（PDGF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、转化生长因子（TGF)等多重有效成分。胰岛素能够促进细胞生长，提高细胞对葡萄 糖的利用率。牛血清白蛋白在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护 作用和载体作用。碱性成纤维生长因子（bFGF)在体内具有潜在的促血管生成活性。血管 内皮生长因子（VEGF)由多数肿瘤细胞、伤口中角质细胞和巨噬细胞产生，其受体仅表达于 血管内皮细胞表面，能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，促进血管形成。丙酮酸钠 可以作为细胞培养中的替代碳源。本发明在基础培养液中添加上述生长因子，从而对内皮 祖细胞的生长起到良好的促进作用。维持了内皮祖细胞良好的生长活力和干细胞特性。
[0019] 本发明还提供了一种内皮祖细胞的培养方法，包括：以本发明提供的培养液将单 个核细胞悬浮至密度为I X IO4个/mL~9X 10 4个/mL，培养24h后，去除培养液及未贴壁 细胞，以本发明提供的培养液培养至细胞70 %~90 %融合，传代。
[0020] 在本发明的实施例中，单个核细胞的制备方法为：将脐带血或骨髓经ficoll淋巴 细胞分离液分离后以PBS缓冲液清洗，制得单个核细胞。
[0021] 在本发明的实施例中，传代的次数为10次。
[0022] 层黏连蛋白包被能够促进细胞贴壁。
[0023] 在本发明的实施例中，培养采用经层黏连蛋白包被的容器，层黏连蛋白包被的浓 度为 10 μ g/mL。
[0024] 在本发明的实施例中，培养的温度为37°C，条件为5% C02。
[0025] 本发明提供了一型硫氧还蛋白在延缓内皮祖细胞衰老、提高内皮祖细胞增殖效率 中的应用。并提供的培养内皮祖细胞的培养液和培养方法。本发明在基础培养液中添加多 种生长因子并添加一型硫氧还蛋白，从而对内皮祖细胞的生长起到良好的促进作用。维持 了内皮祖细胞良好的生长活力和干细胞特性。本发明提供的实验证实，在培养液中添加一 型硫氧还蛋白培养EPCs，细胞传代7代仍保持旺盛