CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及预防兽医学领域，具体地指一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和 Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病毒是α -疱瘆病毒成员，基因组由DNA双链组成。伪狂犬病毒能诱发多 种家畜和野生动物的急性传染病，引起发热、奇痒、脑脊髓炎等症状 [1]。该病毒的天然宿主 是猪，且能感染各年龄段猪，是危害我国和世界生猪养殖业最重要的病原之一。疫苗接种是 伪狂犬病最有效的防控手段，目前市面上有多种商业化的伪狂犬病毒疫苗一一弱毒疫苗、 灭活疫苗和多基因缺失活疫苗。其中多基因缺失活疫苗较之其他疫苗更高效更安全，因此 得到了更广泛的应用。陈焕春等构建的TK/gG双基因缺失疫苗 [2]、郭万柱等构建的TK/gE/ gl三基因缺失疫苗[4]，在近二十年来有效控制了伪狂犬病在我国的流行，为提高生猪养殖 业的效益做出了巨大贡献。
[0003] 而近三年来，伪狂犬病又有卷土重来的态势，先后在华北华中多个地区省份继续 发生和流行，已有初步的研宄表明，与以往毒株相比，新的毒株的抗原性发生变异，且对仔 猪有更强的致病力 [11，12]。由此可见，伪狂犬病毒的变异也是该病防控工作中需要面临的一 大突出问题，因此在研发出能彻底根治伪狂犬病的特效药物之前，建立一种高效快捷的伪 狂犬病毒多基因缺失活疫苗的构建方法，是有效防控变异伪狂犬病毒更大范围流行和减少 重大经济损失的有力保证。
[0004] Cas9蛋白是一种DNA内切酶，能在引导RNA的引导下结合到与引导RNA互补配对 的DNA序列位点，并发挥DNA内切活性，切断DNA双链。CRISPR/Cas9系统作为一种高效的 基因编辑技术，被science和nature评为2013年科学十大进展之一 [1°]，但在医疗临床实 践和农林业生产等方面，特别是在预防兽医领域还未得到实质应用。目前这项技术在多个 物种上都有了相关研宄 [5'6'7]，而其针对伪狂犬病毒这种与人类经济活动息息相关的高传染 性和强致病力的病毒病原，能否发挥多基因敲入的功能，还未有相关报道。
[0005] Cre重组酶蛋白同时具有DNA内切酶和重组酶活性，能特异性识别几种34bp的反 向重复的Iox序列，如ΙοχΡ、ΙοχΝ、1οχ2272等 [9]。若同种同向的一对Iox片段分别位于目 的基因两端，Cre酶可以将成对Iox序列之间的目的基因和其中一个Iox序列切除 [8]。利 用这种特性，将一种（或多种）同向成对的Iox序列放到一个（或多个）外源筛选基因两 端，敲入到病毒的一个（或多个）毒力基因位点，完成目的毒力基因的条件性敲除之后，可 以再用Cre重组酶高效切除外源筛选基因得到一个（或多个）基因缺失毒株 [3]。然而由于 缺乏有力的基因敲入工具，Cre/lox系统作为一种高效的基因敲除工具并没能在病毒疫苗 的制备中得到广泛应用。也没有利用Cre/lox系统来一步实现多基因敲除，以制备多基因 缺失疫苗的报道。
[0006] 参考文献
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【发明内容】
[0019] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和 Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/ Iox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法，包括以下步骤：
[0021] 1)根据伪狂犬病毒目的基因基因序列设计用于特异性靶向目的基因的SgRNA ;再 在目的基因的sgRNA的基础上设计SgRNA双链寡聚核苷酸序列；
[0022] 2)将目的基因的sgRNA双链寡聚核苷酸与线性化的质粒载体连接，转化提取得到 目的基因的sgRNA表达载体；
[0023] 3)靶向伪狂犬病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段的构建；
[0024] a、体外扩增伪狂犬病毒目的基因上游同源臂hml和下游同源臂hm2,纯化；
[0025] b、体外扩增外源筛选基因，并将扩增外源筛选基因插入含有同向成对的Iox序列 的线性化的载体内；
[0026] c、PCR体外扩增得到Iox-外源筛选基因-Iox片段，再进行融合PCR扩增得到 hml-lox-外源筛选基因-lox_hm2片段；
[0027] 4)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将hml-lox-外源筛选基因-l〇X_hm2片段 与目的基因的SgRNA表达载体混合转染，得到转染细胞；
[0028] 5)将转染细胞感染伪狂犬病毒野毒株，得到伪狂犬病毒多基因重组病毒，并纯化。
[0029] 6)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将Cre/lox系统表达质粒进行转染，得到 转染细胞；
[0030] 7)将转染细胞感染伪狂犬病毒多基因重组病毒，得到伪狂犬病毒多基因缺失病 毒，纯化得到伪狂犬病毒多基因缺失疫苗株。
[0031] 进一步地，所述步骤1)中，SgRNA在目的基因上的靶序列符合5' -GN(20)GG、 5' -GN(18)GG、5' -GN(17)GG、5' -N(21)GG、5' -N(20)GG 或者 5' -N(19)GG 的序列排列规则。
[0032] 再进一步地，所述步骤1)中，设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列在其正向寡核苷酸 Forward oligo 5'端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5'端加上AAA，设计得 到一对引物：
[0033] Forward oligo :5' -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;
[0034] Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5? 〇
[0035] 再进一步地，所述步骤步骤3)中，第b小步中，Iox序列为34bp的反向重复的Iox 序列，Iox序列为loxP、IoxN和1οχ2272中任意一种。
[0036] 本发明还提供了一种利用上述方法制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编 辑病毒疫苗株，包括以下步骤：
[0037] 1)分离和纯化野生型伪狂犬病毒；
[0038] 2)伪狂犬病毒gE基因和TK基因 sgRNA的设计；分别在gE基因和TK基因上选择 符合 5' -GN(20)GG、5' -GN(18)GG、5' -GN(17)GG、5' -N(21)GG、5' -N(20)GG 或者 5' -N(19) GG的序列规则的位点；通过BLAST工具比对确定gE-sgRNA(SEQ ID NO. I)和TK-sgRNA(SEQ ID NO. 2)的序列；
[0039] 3)将gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgR