一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于固定化细胞连续发酵领域，具体涉及一种以改性后细菌纤维素膜为载 体固定化梭菌的方法。
【背景技术】
[0002] 梭菌属微生物中，丙酮丁醇梭菌常用于发酵生产丁醇，但传统的游离发酵，生产周 期长，效率低，不能长期连续发酵，产物与菌体难以分离。固定化细胞可以克服以上问题，实 现连续批次发酵，提高生产效率，降低成本。
[0003] 细菌纤维素具有独特的超细网状纤维结构，该材料具有高比表面积，含有大量孔 隙结构，有利于细胞吸附和固定。然而细菌纤维素结构单一，高亲水性，不利于菌体的吸附， 热稳定性以及机械稳定性能差影响其作为固定化材料的稳定性。由于细菌纤维素全部由葡 萄糖苷键和氢键连接而成，化学结构分子式中含有大量的羟基基团，易于改性和表面修饰， 将其与其它原子团或分子组合制成更高性能的物质，在固定化材料方面，将具有良好的发 展潜力和应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，提供一种对细菌纤维素膜进行改性的方法，将该方 法得到的细菌纤维素膜作为梭菌的固定化载体，固定化后的梭菌发酵性能提高，能够连续 批次发酵。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法，该方法包括如下步骤：
[0007] (1)细菌纤维素膜的疏水改性：用酸处理细菌纤维素干膜，清洗，干燥，得到细菌 纤维素膜A ;再用碱处理细菌纤维素膜A，清洗，干燥，得到细菌纤维素膜B ;对细菌纤维素膜 B表面进行乙酰化修饰、酯化修饰、硅烷偶联剂修饰、高分子聚合物修饰或有机膦偶联剂修 饰，制备得到改性的细菌纤维素膜；优选利用乙酰化修饰、硅烷偶联剂修饰或硅烷偶联剂修 饰；最优选硅烷偶联剂修饰。
[0008] (2)改性的细菌纤维素膜固定化梭菌：将步骤（1)得到的改性的细菌纤维素膜固 定在连续发酵罐内，通入丙酮丁醇梭菌菌悬液，自循环培养，得到固定化了丙酮丁醇梭菌的 细菌纤维素膜。
[0009] 只要是能产丁醇的丙酮丁醇梭菌都能作为本发明中改性细菌纤维素膜的固定化 对象，优选的丙酮丁醇梭菌为 Clostridium acetobutylicum B3(CGMCC No. 5234)。
[0010] 所述的自循环培养，其培养条件为：35~40°C，30~40rpm/min，由下自上循环，优 选：37°C，30rpm/min〇 toon] 步骤（1)中，所述的细菌纤维素干膜，通过发酵制备得到，所述的发酵包括如下步 骤：
[0012] (Ia)将木醋杆菌接种到斜面培养基上培养，在30°C条件下培养24h，得到一级种 子；
[0013] (2a)将步骤（la)得到的一级种子转接至种子培养基中，30°C条件下培养18~ 24h，优选培养18h，转速为150rpm，得到二级种子液；
[0014] (3a)将步骤（2)得到的二级种子液转接到发酵培养基中，30°C条件下静置培养 72h，形成细菌纤维素膜，收集发酵液中的细菌纤维素膜，用水冲洗，将其在碱液中浸泡，再 次冲洗使其PH为中性，然后干燥处理，制备得到细菌纤维素干膜，所述的干燥处理是冷冻 干燥，冷冻干燥的条件为：-20°C，24h〇
[0015] 只要能产细菌纤维素的木醋杆菌都能用上述方法产细菌纤维素，优选的木醋杆菌 为 ATCC 23769
[0016] 步骤（Ia)中，所述的斜面培养基，其配方为：葡萄糖80~120g/L，酵母粉8~12g/ L，碳酸钙15~25g/L，琼脂15~20g/L，pH = 6. 4~7. 0,溶剂为水；斜面培养基的配方优 选为：葡萄糖l〇〇g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙20g/L，琼脂15g/L，pH = 6. 8,溶剂为水；
[0017] 步骤（2a)中，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖18~20g/L，蛋白胨8~IOg/ L，酵母粉4~6g/L，磷酸氢二钠2. 5~3g/L，梓檬酸1~L 5g/L，硫酸镁0· 2~0· 3g/L，pH =6. 0~6. 5,溶剂为水；种子培养基的配方优选为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，磷酸氢二钠2. 7g/L，柠檬酸I. 2g/L，硫酸镁0· 25g/L，ρΗ6· 0,溶剂为水；
[0018] 步骤（3a)中，所述的发酵培养基，其配方为：葡萄糖18~20g/L，蛋白胨8~IOg/ L，酵母粉4~6g/L，磷酸氢二钠2. 5~3g/L，梓檬酸1~L 5g/L，硫酸镁0· 2~0· 3g/L，pH =6. 0~6. 5,溶剂为水；发酵培养基的配方优选为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，磷酸氢二钠2. 7g/L，柠檬酸I. 2g/L，硫酸镁0· 25g/L，ρΗ6· 0,溶剂为水；
[0019] 步骤（3a)中，所述的在碱液中浸泡，是将细菌纤维素膜置于0. 1~0. 2mol/L的 NaOH水溶液中，NaOH的浓度优选为0. lmol/L，在60~80°C条件下浸泡1~2h，浸泡温度 优选为80°C，浸泡时间优选为lh。
[0020] 步骤（1)中，所述的用酸处理细菌纤维素干膜，将细菌纤维素干膜在0. 5~lmol/ L的HCl中浸泡1~2h ;HC1的浓度优选为lmol/L，浸泡时间优选为lh。
[0021] 步骤（1)中，所述的用碱处理细菌纤维素膜A，将细菌纤维素膜A在20~50g/L的 NaOH中浸泡2~8h ;Na0H的浓度优选为20g/L，浸泡时间优选为8h。
[0022] 步骤⑴中，所述的乙酰化修饰，包括如下步骤：将细菌纤维素膜B浸入乙酰化试 剂中，细菌纤维素膜B与乙酰化试剂的比例为Ig :5ml~25ml，加入催化剂，在60~100°C 条件下，反应0. 5~3h，反应温度优选为70°C，反应时间优选为2h，反应结束用水冲洗，干 燥，制备得到改性的细菌纤维素膜；
[0023] 所述的乙酰化试剂为已酸酐、氯乙酰或冰醋酸，乙酰化试剂优选为已酸酐；
[0024] 所述的催化剂为硫酸或碘，其中硫酸的加入量为10~12mol/L，碘的加入量为 0. 05~0. 15mmol/L，所述的催化剂优选为硫酸。
[0025] 步骤⑴中，所述的酯化修饰，包括如下步骤：将细菌纤维素膜B按5g/L~10g/L 加入吡啶或三乙胺中，再加入酯化剂，细菌纤维素与酯化剂的比例为0. 5~2g : 100ml，50~ 150°C条件下，优选反应温度为50°C，氮气保护下反应1~3h，反应时间优选为2h，用乙醇清 洗，再用水冲洗，干燥，制备得到改性的细菌纤维素膜；
[0026] 所述的酯化剂是硫酸、醋酸、己酸或十二酸，所述的酯化剂优选为十二酸。
[0027] 步骤（1)中，所述的硅烷偶联剂修饰，包括如下步骤：将硅烷偶联剂与甲苯按体积 比为I : 1~2的比例混合，将细菌纤维素按5~20g/L加入硅烷偶联剂中，再加入与硅烷偶 联剂等摩尔量的异咪唑，室温下反应1~3h，反应时间优选为2h，用水清洗，干燥，制备得到 改性的细菌纤维素膜；
[0028] 所述的硅烷试剂是烷基二甲基氯硅烷、丁基二甲基氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷或 十二烷基二甲基氯硅烷，所述的硅烷试剂优选为丁基二甲基氯硅烷。
[0029] 步骤（1)中，所述的高分子聚合物修饰，包括如下步骤：将细菌纤维素膜B按照 5~20g/L加入高分子聚合物中，得到混合物，将该混合物与甲苯按照体积比为1:1~2的 比例混合，以Sn (Oct) 2为催化剂，80~95°C，优选80°C，反应12~24h，优选24h，用水清洗， 干燥，制备得到改性的细菌纤维素膜；
[0030] 所述的高分子聚合物为聚乳酸或聚己内酯，所述的高分子聚合物优选为聚乳酸。
[0031] 步骤（1)中，所述的有机膦偶联剂修饰，包括如下步骤：将膦酸或亚磷酸衍生物溶 于有机溶剂制成饱和溶液，按照流速为1~2ml/min逐滴加入到细菌纤维素薄膜中，60~ l〇〇°C，有限60°C，在氮气保护下反应2~6h，优选反应2h，乙醇清洗，再用水清洗，干燥，制 备得到改性的细菌纤维素膜；
[0032] 所述的亚磷酸衍生物为苯基膦或苯基次膦酸，所述的亚磷酸衍生物优选为苯基 膦；所述的有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃，所述的有机溶剂优选为二氯甲烷。
[0033] 上述细菌纤维素膜固定化梭菌的方法制备得到的固定化了