一种检测cpt-ⅱ基因突变的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPT- II基因突变的引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒喊掠桐醜转移酶 II (Carnitine Palmitoyltransferase-II，CPT-II)位于细 胞线粒体内膜上，是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一，可逆地催化从酰基辅酶A将 酰基转移至L-肉毒碱的反应，在长链脂肪酸从线粒体外膜转运到线粒体内膜过程中起重 要作用。CPT- II基因全长3090个核苷酸，定位于1ρ32染色体上，含有5个外显子及4个内 含子，编码658个氨基酸肽链。CPT- II基因突变引起CPT- II功能缺陷，肉碱依赖的转运系 统功能将遭到破坏，导致脂酰肉碱不能有效地转化成相应的脂酰辅酶A，故线粒体中长链酰 基肉碱大量聚集，血中酰基肉碱明显增高，从而引起一系列生化紊乱。
[0003] 目前已发现90多种与疾病相关的CPT-II基因突变类型，其中大部分为错义突变， 也包括含两种内含子与外显子交界区的剪切点突变。
[0004] 对于CPT- II基因突变的检测通常为针对某一个热点突变进行检测，尚未有关于 利用多个特异性引物对CPT- II基因多个突变同时进行测定的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPT- II基因突变的引物和试 剂盒。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT- II基因的全部外显子及外显 子/内含子交界区突变的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种检测CPT- II基因突变的引物，包括扩增CPT- II基因5个外显子及外显子/ 内含子交界区的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 16所示，具体如下：
[0009] CPT- II -Pl-F :5' - CACAGTCTCGCAAGGATGG-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPT- II -Pl-R:5' -GCGGAAACGGGTTCACTAG-3' ；（SEQ ID N0.2)
[0011] CPT- II -P2-F :5' - TTACACTGACCCTGCTTTCT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT- II -P2-R :5' - TTACATCTGCCACAACCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT- II -P3-F :5' - TTTTAGGGCTATGCTGTTGG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT- II -P3-R :5' - TTAGCAGGAAGTATGTCAGG-3' ；（SEQ ID NO. 6)
[0015] CPT- II -P4-1-F :5' -GTGGAGGACGCCTGTAATC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT- II -P4-1-R :5' - ACGCATTGACCAGGTAGGC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT- II -P4-2-F :5' - CCGGTTTCTGAAGACACTCC-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPT- II -P4-2-R :5' - CCAGATGTCTCGGTTCTCAC-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT- II -P4-3-F :5' - TCGGAAATCCAGGCACATC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT- II -P4-3-R :5' - AGAGCCATCCTTGGCGATA-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT- II -P4-4-F :5' - AAGATGGGAACATTGTGAGC-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT- II -P4-4-R:5' -GATTTAGGCTTGCTTACCCA-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT- II -P5-F :5' - AGGTTAGTCAGTTGGTGGTG-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT- II -P5-R :5' - CCTGGGTTCAAGCAATTCTG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] 其中，F为正向引物，R为反向引物。
[0026] CPT- II基因外显子4较大，有1305个碱基，且该外显子内含有105个基因多态性， 进行引物设计比较困难。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级结构进 行了精确的分析，将CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区分成四段，即4-1、4-2、 4-3、4-4,然后为每一段分别设计一对引物，分别如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 14所示。
[0027] 本发明还提供了一种检测CPT- II基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增 CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区的引物。
[0028] 本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
[0029] 用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTPUOXPCR缓冲液和双蒸水。
[0030] 进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
[0031] 本发明还提供非诊断目的检测检测CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子 交界区突变的方法，包括如下步骤：
[0032] (1)提取待测样本DNA ;
[0033] (2)以样本DNA为模板，用扩增CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区 的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0034] (3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
[0035] (4)对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT- II基因序列进行比对， 从而确定CPT- II基因的突变位点。
[0036] 步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性 扩增引物的退火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0037] 步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
[0038] 步骤（3)中，测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25个循环。
[0039] 测序扩增反应体系采用IOul,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
[0040] 步骤⑷中，测序的方法为Sanger法。
[0041] 本发明的有益效果：
[0042] 本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增 引物即可对CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个 潜在的突变位点检测出来。
【附图说明】
[0043] 图1为CPT- II基因外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中， M泳道：DNA marker，l~8泳道：分别为CPT- II基因外显子及交界区1、2、3、4-1、4-2、4-3、 4-4 和 5〇
[0044] 图2Α为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-3测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2A显示：在cDNA 1055位置，T突变为G。
[0045] 图2B为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-4测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2B显示：在cDNA 1102位置，G突变为A。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0047] 下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
[0048] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0049] 实施例1 :特异性扩增引物的设计
[0050] 根据NCBI数据库中CPT- II正常基因的参考序列设计特异性扩增引物，该特异性 扩增引物应满足以下条件：
[0051] (1)产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互 补；
[0052] (2)所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5°C，各产物退火温度在 52°C -58°C之间，保证扩增的特异性和稳定性；
[0053] (3)PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在18-20bp之 间。
[0054] 本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。
[0055] 实施例2 :样本DNA提取
[0056] 本发明所用的阳性样本取自山东的受试者，经医院确诊为肉毒碱棕榈酰转移酶II 缺乏症，经受试者同意，取其血液样本。