微生物转化生产白藜芦醇的方法和布鲁塞尔德克酵母菌突变株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，特别是涉及一种以微生物 转化生产白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇（resveratrol)为一种植物多酚，主要为植物受到环境逆境时如：外 力伤害、UV过度照射、昆虫及微生物入侵感染时所生成的抵御机制，为一种植物抗菌 素(phytoalexins)(Anastasiadi et al. , 2012 ；Burns et al. , 2002 ；Fremont, 2000 ； Potrebko and Resurreccion, 2009)。白黎芦醇化学名称为三羟基二苯乙稀 (3,5,4'-trihydrozystibene)(Abbott et al·)，最早于 1940 年，学者高网（Takaoka)由 白藜芦（white hellebore ;Veratrum grandiflorum 0· Loes)的根部分离出鉴定，随后于 1963年由中国传统中药材-虎杖（Polygonum cuspidatum)的根莖部中也被分离出有白藜 芦醇成分。白藜芦醇除了于上述植物中被发现，其也存在一些特定的植物中，如葡萄、蓝莓 等某些莓果类，或是花生及石槽等（Burns et al·，2002 ;Counet et al·，2006;Jerkovic et al·，2010 ;Manach et al·，2004 ;Tome-Carneiro et al·，2012 ;Wang, 2012)，然而这 些的植物所含的白藜芦醇含量差异很大，同时，在某些植物中白藜芦醇会以糖苷（piceid; polydatin)的形式存在于体内。
[0003] 目前已知白藜芦醇，具有抗老化、降低糖尿病、肝病、心脏病、癌症及其他代谢症候 群相关疾病的罹患机率，然而因其于植物中含量稀少且萃取不易，使其售价及应用上均受 限制。
[0004] 白藜芦醇化合物有两种异构物分别为顺式（Cis)与反式（trans)结构，反式结 构才有生理活性，反式结构经UV照射后会变为顺式结构而失去生理活性（Potrebko and Resurreccion, 2009)，于植物中白藜芦醇会与糖结合形成较稳定的糖苷形式，糖苷形式有 接单糖于不同位置（Counet et al.，2006 ;Jerkovic et al.，2010 ;Sun et al.，2010 ;Wang et al.，2007;Zhang et al.，2007)的形式，也有同时接两个单糖的形式，但在虎杖中主要 以单糖接于3'-位置上的羟基形式居多数（Sun et al.，2010;Wang et al.,2007;吴佳 颖，2007)，这些不同的接糖形式主要为稳定白藜芦醇于生物体内，于适当时机时生物体可 直接转化生成白藜芦醇应用。
[0005] 目前生产白藜芦醇的方法，有植物萃取法、化学合成法、植物转化法以及微生物基 因工程等，然而植物中白藜芦醇主要经由酪胺酸与苯丙氨酸途径合成，其中主要关键步骤 为合成二苯乙烯合成酶（stilbene synthase) (Donnez et al·，2009)，目前文献所列以微 生物基因工程生产白藜芦醇的方式，可分为酵母菌与细菌两部分（Donnez et al.，2009)。
[0006] 文献研究指出：目前萃取虎杖中白藜芦醇方法主要有五种，分别以碱萃取法 (Alkaline extraction)、溶剂萃取法（Solvent extraction)、超音波辅助法（Ultrasonic extraction)、索式回流萃取（Soxhlet extraction)以及CO2超临界流萃取法（SFE-C02) (Benova et al.，2010 ;Cho et al.，2006 ;Du et al.，2007 ;Lei et al.，2007 ;吴佳 颖，2007)。所有的萃取方法均有其优缺点，然而就单纯以萃取效果而言，超音波辅助法萃取 效果最佳（Lei et al.，2007)。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种以微生物转化生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，包括：(a)提 供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质，其中该基质包括白藜芦醇前驱 物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质；(b)将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基 质加入至一培养基中以形成一混合物；以及（c)对该混合物进行发酵，以使于该混合物中 存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。
[0008] 本发明也提供一种新颖的布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)突变株， 其是于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编 号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌，并且是于2013年7月11日保藏于德国微生物 菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)， 保藏编号为DSM 27483的布鲁塞尔德克酵母菌。
【附图说明】
[0009] 图IA是显示初步选择的各菌株使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0010] 图IB是显示初步选择的各菌株使用石榴皮为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0011] 图2是显示不同的布鲁塞尔德克酵母菌使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的 实验结果。
[0012] 图3是显示所挑选的12株突变株于不同培养时间点产生的β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)量。
[0013] 图4Α是显示利用5公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以水、醋酸缓冲溶液或福格 尔最小盐类培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)来培养编号72号的突变株进行 白藜芦醇转化生成的结果。
[0014] 图4B是显示利用20公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以醋酸缓冲溶液来培养编 号72号的突变株进行白藜芦醇转化生成的结果。
【具体实施方式】
[0015] 在本发明一实施方式中，本发明提供一种以上微生物转化生产白藜芦醇 (resveratrol)的方法。本发明的以微生物转化生产白藜芦醇方法可包括下述步骤，但不限 于此。
[0016] 首先，提供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质。上述基质可 包括，但不限于，白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质。
[0017] 上述德克酵母属的酵母菌或其突变株可包括一布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)或其突变株，但不限于此。上述布鲁塞尔德克酵母菌或其突变株的例子，可 包括，布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440或其突变株等，但不限于此。又，布鲁塞尔德克酵母 菌BCRC 21440的突变株的例子则可包括，但不限于，于2013年1月9日保藏于台湾食品工 业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌 (此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏编号为 DSM27483)等。
[0018] 在一实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵 母属的酵母菌或其突变株可为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440。在另一实施例中，于本发 明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵母属的酵母菌或其突变株可为， 于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为 BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种 保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏 编号为 DSM 27483)。
[0019] 于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述白藜芦醇前驱物可包括白 藜芦醇糖苷等，但不限于此，而白藜芦醇糖苷的例子可包括，但不限于虎杖糖苷等。又，于 本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述含有白藜芦醇前驱物的该植物基质的 例子可包括，但不限于，虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、蓝莓、桑葚、蔓越莓 或、波萝蜜等。在一实施例中，上述含有白藜芦醇前驱物的植物基质可为虎杖，而含于虎杖 的白藜芦醇糖苷为虎杖糖