一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘蔗渣是一种重要的木质纤维类可再生原料，我国是世界上甘蔗种植量第三大的 国家，南方是中国主要种植甘蔗的地区，每年甘蔗总产量达到7000多万吨，同时会产生700 万吨的甘蔗渣。
[0003] 甘蔗渣中主要组分为纤维素、半纤维素和木质素。目前甘蔗渣的主要用途是燃烧 发电（轻工科技，2013,（11): 11-12·)、作为家畜饲料（中国专利申请号94113455. 5)、替 代传统的木材资源作为造纸和生产高密度材料（中国塑料，2008,（02) :57-61)、作为食用 菌的培养基（食用菌，1980,（02) : 12-16)、以及开发生产高附加值产品：如开发生产木糖醇 (科技通报，2004,（I) :37-41)、阿拉伯糖（氨基酸和生物资源，2009,（I) :8-12.)、糠醛（化 工科技市场，2001，（11) : 12-15)。中国专利CN 1060464C公布了用蔗渣碱木质素催化氧化 制备丁香醛和香兰素的方法。中国专利CN 103614435A公布了一种从甘蔗渣制备低聚木糖 的方法。
[0004] 丁二酸是工业上一种重要的C4平台化合物，在食品、医药、化学工业以及其他领 域都有着广泛的应用。目前文献报道的发酵生产丁二酸研宄所用的培养基碳源主要是葡萄 糖，开发价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的途径之一。巴西Borge等报道用 稀硫酸酸解甘鹿澄，得到的糖液作为碳源，用A. succinogenes CIP 106512厌氧摇瓶发酵丁 二酸 24h，得到丁二酸的浓度最高为 22. 5g.L-1 (Industrial Microbiology and Biotechnol ogy，2011，38:1001-1011.)。徐蓉等用稀硫酸酸解甘蔗渣，再用纤维素酶水解预处理的残渣， 甘蔗渣水解液发酵丁二酸，得到20g. Γ1的丁二酸（化工进展，2013, 04:874-877.)。但用 这些方法发酵生产的丁二酸，产量较低，增加了后续提取的成本。本发明提供了一种甘蔗渣 高效水解和生产高浓度丁二酸的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用廉价甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法。
[0006] 所述发酵生产丁二酸的方法，是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、水解得到的水解糖液 作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后 的残渣（干重）作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁二酸。
[0007] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，是以榨糖工业废弃 物甘蔗渣为原料，将干的甘蔗渣粉碎，过20-40目筛，40-70°C烘干保存，用质量浓度为 0. 5-5 %的NaOH溶液，按固液比1:1-1:15 (w/v)，121 °C高温预处理甘蔗渣2-4h，过滤水洗得 甘蔗渣，45-70 °C烘干备用。
[0008] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，稀碱预处理甘蔗渣后 的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯仿萃取，得到糠醛粗品。
[0009] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，是将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为 3~10%的溶液，在纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶的协同作用下水解，水解温 度40-70°C，pH调至4. 0-6. 5,转速100-250r. mirT1，时间24-72h。水解后，经离心得水解糖 液，固体烘干即得甘蔗渣水解后的残渣。
[0010] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果胶 酶对每克底物的的添加量分别为：l〇-35FPU. g'SO-UOU. g'10-SOU· g-1和5-30U. g-1。
[0011] 所述甘蔗渣水解后的残渣，在本发明的一种实施方式中，添加量为8~18g. L'
[0012] 所述反复分批发酵或反复补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是指采用 分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中甘蔗渣水 解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需 要接种，直接进行下一批次发酵。
[0013] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：（1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备 发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20~100g. Γ1; (2)在发酵培养基中添加 4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20~60h ; (3)发酵结束后静止，待发酵 液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发 酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0014] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，包括：甘蔗渣水解液糖 浓度20~100g. L-1，玉米浆浓度10~30g. L-1，无水氯化钙浓度0. 05~0. 5g. L-1，磷酸氢二 钾浓度1~5g. Γ1，磷酸二氢钠浓度4~12g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 05~0. 5g. Γ1，硫化钠 浓度 0· 05 ~0· 5g. L 1O
[0015] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，甘蔗渣水解液糖浓度 55g. L 1O
[0016] 所述步骤（2)的发酵，在本发明的一种实施方式中，通入C02/N2气体控制发酵过程 为厌氧条件，饱和似!10) 3控制发酵pH 5. 8~6. 5。
[0017] 所述步骤（2)的补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是发酵培养基初始 糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g. Γ1时，开始补加甘蔗渣 水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. Γ1，发酵25-50h。
[0018] 所述步骤（2)的分批，在本发明的一种实施方式中，是发酵3-5个批次。
[0019] 所述琥泊酸放线杆菌，在本发明的一种实施方式中，是A. ssuccinogenes F3-21或 琥珀酸放线杆菌 CGMCC NO. 1593、CCTCC NO :M 2012036。
[0020] 所述步骤（3)中的发酵结束，在本发明的一种实施方式中，是指发酵液还原糖浓 度小于10g. I71或小于5g/L。
[0021] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：（1)甘蔗渣预处理：甘蔗渣粉碎 20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶液，按照固液比1:1~1:20 (w/ v)，121°C高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70°C烘干备用；（2) 甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加纤维素酶、木聚糖酶、 β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速100-250r. min-1的条 件下，水解24~72h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添 加量分别为：1〇~35FPU. g'50~120U. g'10~80U. g4和5~30U. g'离心，得甘蔗渣 水解糖液和甘蔗渣水解残渣；（3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培 养，发酵培养基组成为：甘蔗渣水解液糖浓度20-100g. Γ1，玉米浆浓度10-30g. Γ1，无水氯 化妈浓度0. 05-0. 5g. I71，磷酸氢二钾浓度l-5g. I71，磷酸二氢钠浓度4-12g. I71，六水氯化镁 浓度0.05-0.58.171，硫化钠浓度0.05-0.58.17 1;在发酵培养基中添加4~2(^丄_1的甘蔗渣 水解后的残渣（以干重计），然后按5~10%的接种量接种种子液，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下，发酵20~60h ;发酵结束后静止，待发酵液中的甘蔗渣水解残渣 下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直 接进行下一批次发酵。
[0022] 本发明还要求保护根据所述方法得到的丁二酸及其在食品、化学和制备药物方面 的应用。
[0023] 本发明还提供了一种综合利用甘蔗渣的方法，所述方法包括：（1)甘蔗渣经粉碎、 稀碱预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液 中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复 补料分批发酵生产丁二酸；（2)稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯 仿萃取，得到糠醛粗品。具体可参见上述发酵生产丁二酸的方法。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] (1)实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，用4~20g. Γ1的甘蔗渣水解残渣作为菌 体附着载体循环发酵丁二酸，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵 效率。（常规发酵中，种子培养12_24h，种子培养基一般含10g. L 1以上的酵母霄，种子约占 原料成本的2-5% )。同时，反复批次发酵能够进行，3批次循环分批发酵的丁二酸浓度均