家蚕血细胞特异表达基因组织蛋白酶o调控元件的鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及本发明涉及生物技术领域，家蚕血细胞特异性表达蛋白酶〇基因启动 子分析与鉴定。具体涉及家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶〇基因启动子 的克隆，分析发现其血细胞特异表达调控元件的方法。
【背景技术】
[0002] 家蚕是一种具有重要经济价值的昆虫，作为鳞翅目的模式生物，家蚕在理论研宄 和生产应用方面都具有重要作用。目前对家蚕血细胞的研宄比较少，主要原因是可以利用 的研宄手段有限。随着家蚕基因组框架图和精细图谱绘制工作的相继完成，人类对家蚕的 研宄和认识已经进入后基因组时代，"发现基因，研宄基因，利用基因"是我们现在研宄家蚕 的主要策略，目前已经发现众多的家蚕血液特异表达基因，面对这些大量的未知基因，如何 研宄和利用这些基因是我们目前要解决的主要任务之一。随着家蚕转基因技术的突破和完 善，转基因已经成为家蚕研宄基因和利用基因的强有力工具，但转基因技术也需要其他研 宄工具的配合才能更好的发挥功效。这些血细胞特异高量表达的基因可能具有非常重要的 作用，其中也包括不少和家蚕免疫抗性相关的基因，要通过转基因来研宄和利用这些家蚕 血细胞特异高量表达的基因就需要有一个家蚕血细胞特异高量表达的启动子，但目前没有 家蚕血细胞特异高量表达启动子的相关报道。研宄家蚕血细胞特异性的表达基因及其功能 与调控，对于阐释家蚕血细胞的生长发育分子机理具有重要意义。
[0003] Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方 法基于让已经转入杆状病的质粒的位点特意转座子的表达框的质粒在大肠杆菌中扩增。 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目 的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。一个大肠杆菌 宿主，DHlOBac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac表达结构后可以 产生重组杆粒。一个控制表达的质粒，包括Gus或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆 状病毒，表达β -葡萄糖酸酐酶或氯霉素乙酰转移酶。Y. Zhai等人以Bac-to-Bac系统结合 萤光素酶报告基因重构载体分析了家蚕乙酰葡糖胺糖苷酶的启动子活性，表明启动子活性 与基因表达水平一直于在血液、皮肤、脂肪体高表达，截断分析发现基因 -347~-223bp存 在核心调控元件。J. 等人应用转基因技术分析了家蚕内源性卵黄蛋白原基因启动子 的功能特性，实验表明其启动子只在蛹期雌性家蚕脂肪体表达，具有性别，组织、时间三重 特异的表达模式。高志宏等利用Bac-to-Bac系统对丝素重链启动子进行研宄，在丝腺中， 2. Ikb的启动子仅在后部丝腺驱动EGFP蛋白的表达，而在中部丝腺中不表达，0. 9k~2. Ik 的区域可能存在其他的顺式调控元件
[0004] 本研宄首先通过家蚕组织芯片表达数据、转录组数据和RT-PCR等方法，筛选出蛋 白酶0基因为血细胞特异表达候选基因。然后对相关基因进行克隆，并对候选基因的启动 子区进行克隆。我们成功对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行了改进，建立了一套有效的 血细胞启动子检测体系。最后在细胞和个体水平对候选基因启动子活性进行检测，并对其 组织特异性进行了验证。通过本研宄得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶O基因启动子，分 析发现其启动子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制 该基因在血细胞的特异表达。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及到家蚕血细胞特异性表达蛋白酶0基因启动子分析与鉴定。具体涉及 家蚕血细胞特异性表达基因的筛选方法及由蛋白酶〇基因启动子的克隆，分析发现其血细 胞特异表达调控元件的方法。
[0006] 1、首先通过家蚕组织芯片表达数据、转录组数据和定量RT-PCR等方法，筛选出血 细胞特异表达候选基因蛋白酶〇基因，成功验证该基因家蚕血细胞特异表达。
[0007] 2、成功对相关基因启动子进行克隆，并进行功能分析。
[0008] 3、克服了无家蚕血细胞特异启动子这一困难，我们成功对Bac-to-Bac杆状病毒 表达系统进行了改进，建立了一套有效的血细胞启动子检测体系。最后在细胞和个体水平 对候选基因启动子活性进行检测，并对其组织特异性进行了验证。为家蚕血细胞特异高量 表达基因的研宄和利用提供了有利的工具。
[0009] 4、通过本研宄得到家蚕血细胞特异性基因蛋白酶0基因启动子，分析发现其启动 子在转录起始位点上游-333到-80之间片段具有组织特异性调控元件，控制该基因在血细 胞的特异表达。
[0010] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下
【附图说明】
[0011] 图1芯片数据筛选家蚕血细胞特异基因
[0012] 家蚕组织芯片数据进行过滤，表达强度大于800,则认为该基因表达，分析发现芯 片探针号为SW05834和SW17255,两个探针在SilkDB数据库中对应的同一个注释基因编号 为BGIBMGA009231，该基因表达集中在血液中，且表达量较高，表明具有血液特异性。
[0013] 图2家蚕组织蛋白酶0组织表达谱
[0014] 提取家蚕各组织的RNA反转成cDNA之后进行Real Time PCR检测，结果证明了组 织蛋白酶0基因在血液中特异表达。
[0015] 图3 5' RACE片段克隆结果
[0016] 1 :保守序列克隆；2 :5' RACE片段；
[0017] 利用PCR和RACE技术，克隆得到了家蚕组织蛋白酶0的5'末端序列，确定了组织 蛋白酶0基因的转录起始位点（TSS)。
[0018] 图4 TFSEARCH对启动子组织蛋白酶0启动子转录因子
[0019] 在线使用TFSEARCH对启动子转录因子进行分析HSF :heat shock facteor (热 激蛋白因子）Dfd :Deformed 元件 BR-C :Broad_Complex 元件 Hb : (Hunchback)元件 Kr : (Krueppel)元件 TSS :转录起始位点。图中表示了 pBmCat0(1912bp，_1836/+76，）、 pBmCatOl(1530bp，-1454/+76)、pBmCat02(938bp，-862/+76)、pBmCat03(409bp，-333/+76)、 and pBmCat04(l56bp，_8〇/+76)引物的位点。
[0020] 图5组织蛋白酶0启动子序列各截断示意图
[0021] 图6组织蛋白酶0启动子序列各截断片段PCR图
[0022] I :PBmCat0(1912bp，-1836/ + 76,）2 :pBmCat01 (1530bp，-1454/ + 76) 3 : pBmCat02(938bp， -862/+76)4 :pBmCat03(409bp， -333/+76)5 :and pBmCat04 (156bp, -80/+76) M ：marker
[0023] 按照（图4)示意图对家蚕组织蛋白酶0基因组序列分别设计该基因各截短启动 子。SEQ ID No :16 ~SEQ ID No :21 所示的扩增引物 pBmCat〇-F/pBmCat〇-R，pBmCat01-F/ pBmCat〇-R，pBmCat02_F/pBmCat〇-R，pBmCat03_FpBmC/pBmCat〇-R 和 pBmCat04_F/pBmCat〇-R 引物对分别扩增出 pBmCat0(1912bp，-1836/+76,），pBmCat01(1530bp，-1454/+76)， pBmCat02(938bp，-862/+76)，pBmCat03(409bp，-333/+76)，and pBmCat04(156bp，-80/+76) 的启动子片段，分别测序验证，证明克隆启动子的正确。
[0024] 图7 pFastBac?Dual载体以及载体改装示意图
[0025] 图7-a为pFastBac?Dual载体结构图，图7-b为载体改装示意图：pPH作为阳性对 照含有两个启动子P pitl启动子能驱动EGFP表达的，P PH启动DsRed的表达，P Λ P作为阴性对 照，只含有能驱动EGFP表达的Ppici, PHS为实验组Ppici驱动EGFP表达，而我们的组织蛋白酶 〇的启动子驱动DsRed的在组织中的表达。EGFP信号代表了被病毒侵染的程度，而DsRed 信号表示启动是否在该组织有活性。
[0026] 图8组织蛋白酶0启动子片段重组Bacmid的鉴定
[0027] 图 8-a 中，1 :蓝斑 2 :白斑 A 3 :白斑 B 4 :白斑 C (1-4 引物为 EGFP-R/M13-R) 5 : 蓝斑6 :白斑A 7 :白斑B 8 :白斑C(5-8引物为M13-F/M13-R) 9、Marker图8-b中1 :蓝斑 2 :pFast 空载 3 :pPH 4 :pCat0(l-5 引物为 EGFP-R/M13-R) 6 :2K plus marker 7 :蓝斑 8 : pFast 空载 9 :pPH 10 :pCatO
[0028] (7-11 引物为 M13-F/M13-R) 12 :marker
[0029] 白色单菌落扩大培养提取重组病毒Bacmid，M13F/M13R引物分别位于病毒Bacmid 的转座元件mini-attTn7的两侧，当无外源基因插入时PCR扩增会出现约300bp，转化后发 生重组的Bacmid PCR产物会明显增大大小为2560bp加上插入克隆片段的大小，如图所示 pCatO重组Bacmid用SEQ ID NO 14~SEQ ID吣：15所示的扩增引物組34/]?13-1?对可 以扩出6000bp的片段，而蓝斑没发生重组只有300bp大小，说明发生了重组，EGFP-R/M13-R 引物对能在白斑扩出4000bp左右的特异片段，而蓝斑无法扩出任何片段说明，插入的片段 就是我们克隆的启动子序列已经EGFP和dsred的片段。同样的原理对pFast空载以及pPH 也做了鉴定，说明了载体的构建准确，已经重组Bacmid的正确性。
[0030] 图9组织蛋白酶0启动子各截短片段在细胞系SWU-3上启动子活性检测
[0031] 通过细胞转染和病毒感染swu-3细胞发现，阴性对照p Λ P只能表达绿色荧光蛋白 说明病毒感染的状况，阳性对照PPH能