能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法及其引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子遗传学领域，具体是涉及一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的 分子标记方法及其引物对。
【背景技术】
[0002] 目前，国内外毛纺产品已向轻薄、柔软、挺括、高档的方向发展，世界羊毛品质也出 现了划时代的变革，主要表现在羊毛细度上。羊毛细度是羊毛重要的品质性状和经济性状， 毛越细（羊毛纤维直径越小），毛柔软度越好，纺织性能越高，对羊毛价格有重要的影响。我 国是世界上消耗羊毛最多的国家，羊毛的自给率仅为1/3,供求缺口很大，每年需要从国外 进口大批细羊毛，羊毛成为我国唯一依赖进口的大宗畜产品。因此，应用现代分子育种新技 术快速培育超细毛羊、扩大优质细毛羊种质规模势在必行。
[0003] 中国美利奴羊（新疆军垦型）的培育始于1972年，至今已培育出六个品系，分别 为车星A型品系、车星B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系和U品系。如何 进一步改良羊毛细度，培育超细毛种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。羊毛 细度是一种高遗传力的性状，遗传力达0.59。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性 别和环境的干扰，实现早期、快速和准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。 因此，寻找羊毛细度相关基因及分子标记对于优质细毛羊育种工作有重要意义。
[0004] Immature Colon Carcinoma Transcript I (ICTl)基因编码非成熟结肠癌转录因 子1，属于线粒体释放因子家族。ICTl具有肽酰-tRNA水解酶活性，是39S线粒体核糖体大 亚基的组成部分之一，对保证细胞存活有至关重要的意义。ICTl基因在畜禽中的研宄鲜有 报道。
【发明内容】
[0005] 基于以上不足之处，本发明公开一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法 及其引物对，能够对羊毛细度进行选择。
[0006] 本发明所采用的技术如下：
[0007] -种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法所用引物对，上引物ICTlF :如 序列表Seq No. 1所示；下引物ICTlR :如序列表Seq No. 2所示。
[0008] 本发明还具有如下技术特征：
[0009] 1、一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，包括如下步骤：
[0010] (1)根据绵羊ICTl基因第5外显子区C55420707T位点设计一对引物ICTlF和 ICT1R，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶Ban II酶切 PCR扩增产物，获得酶切产物；
[0011] (2)使用质量浓度为2%~3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据 电泳分离结果进行基因型判定；
[0012] (3)根据中国美利奴羊试验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y = μ+G+L+A+GXL+GXA+AXL+e，然后利用统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析，并 估计性状的最小二乘均值；
[0013] (4)根据基因型将中国美利奴羊试验群体分为三种类型，从而实现预示和鉴定绵 羊羊毛细度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法。
[0014] 2、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（1) PCR扩增的反应体系如下所示：
[0015] 50 ng/pL绵羊基因组DNA I pL 10 μΜ引物 ICTlF 0.2 μL 10 μΜ引物 ICTlR 0.2 pL 10 X扩增缓冲液 1 μL 2.5 mM dNTP Mixture 0.8 μL 5 υ/μΙ> Easy-Taq 0· 1 μΙ> CldH2O 6.7 pL
[0016] PCR扩增条件为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，65°C退火25s，72°C延伸30s，共 36个循环72°C终延伸10min，4°C终止反应。
[0017] 3、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（I) 获得的PCR扩增产物，序列如Seq No. 3所示。
[0018] 4、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（1) 酶切体系如下所示：
[0019] IOXCutSmart Buffer IyL
[0020] 内切酶 Ban II IyL
[0021] PCR 产物 IOyL
[0022] 酶切条件为：37°C酶切lh。
[0023] 5、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（2) 基因型的判定的标准如下所示：
[0024] (1)电泳呈现两条带，大小为249bp和89bp，则绵羊ICTl基因第5外显子区 C55420707T位点未突变时，PCR扩增产物可以被Ban II酶完全切开，将其命名为CC基因 型；
[0025] (2)电泳呈现一条带，大小为338bp，则绵羊ICTl基因第5外显子区C55420707T 位点突变时，PCR扩增产物不能被Ban II酶切，将其命名为TT基因型；
[0026] (3)电泳呈现三条带，大小为338bp、249bp和89bp，则绵羊ICTl基因第5外显子 区C55420707T位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被Ban II酶完全切开，将其命名为CT 基因型。
[0027] 6、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（3) 构建基因型效应统计模型，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为 品系效应，A为年龄效应，GXL为基因型和品系的互作效应，GXA为基因型和年龄的互作效 应，AXL为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应。
[0028] 7、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛细度的分子标记方法，所述的步骤（3) 中中国美利奴羊均为1~12岁的新疆军垦型母羊。
[0029] 本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因 型对绵羊羊毛细度进行选择时，将使绵羊羊毛的细度取得很大的遗传进展。利用本发明可 以对羊毛细度进行选择，不仅为绵羊羊毛的品质性状改良提供了一种有效的分子标记育种 手段，也为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法。 本发明可以有效的应用于超细毛绵羊的分子辅助育种领域，实现种羊的早期选种，出生后 即可进行选留，加速绵羊的育种进程。
【附图说明】
[0030] 图1为酶切产物的电泳分离图。
【具体实施方式】
[0031] 下面根据说明书附图举例对本发明做进一步解释：
[0032] 实施例1
[0033] 中国美利奴羊基因组DNA的获得
[0034] 采集绵羊耳组织，_20°C保存备用。采用常规的苯酚/氯仿法提取绵羊基因组DNA。 具体方法如下：
[0035] (1)取中国美利奴羊（新疆军垦型）耳组织5g，剔除结缔组织，将组织块用70%酒 精清洗、消毒，置于Eppendorf管内，用剪刀剪碎，或研磨碎；
[0036] (2)待Eppendorf管内的酒精完全挥发之后，加入分离缓冲液700 μ L，悬浮剪碎的 组织后，加入蛋白酶1((201^/1^)5.01^，55°〇作用8-1211，直到无组织块为止；
[0037] (3)将消化好的组织液取出，加入等量组织液的饱和酚，混匀lOmin，4°C，12000r/ m，离心 IOmin ;
[0038] (4)取上清液，加等量的苯酷/氯仿，轻轻混勾10min，4°C，12000r/m，离心10min ;
[0039] (5)取上清液，加等量的氯仿，混勾10min，4°C，12000r/m，离心10min ;
[0040] (6)取上清液，加2倍量的无水乙醇沉淀，颠倒混匀后，室温下静置10-20min，DNA 沉淀形成白色絮状物；
[0041] (7)弃去上清，再加质量为浓度70%的乙醇清洗，弃去上清，在吸水纸上吸取多余 液体，自然风干后，加适量的TE溶解，_20°C保存；
[0042] (8)若DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000转/分钟短暂离心，取上清；如要去除 其中的RNA，可加入5 μ L RNaseA(K) μ g/ μ L)，37°C保温30分钟，用酚抽提后，按步骤4-7 重新沉淀DNA。
[0043] 实施例2
[0044] 绵羊ICTl基因酶切产物的获得
[0045] 根据绵羊基因组中的ICTl基因 C55420707T位点设计一对引物ICTlF和ICT1R，然 后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，再用内切酶Ban II酶切PCR扩增 产物，获得酶切产物，如图1所示。
[0046] 引物序列如下所示：
[0047] ICTlF