一种谷物粉状食品中稻米成分的hda检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种检测谷物粉状食品中稻米 成分的HDA检测方法及试剂盒。 技术背景
[0002] 随着人们生活水平的日益提高，以及生活节奏的加快，越来越多的谷物粉状食品 出现在人们的日常生活中。稻米在未加工前有特异的形态特征，容易与其它谷物进行区分， 但是如果将稻米制成粉状，与其它粉状的谷物相混合，则不易辨别。一些假冒伪劣商品标注 含有稻米成分，可能不含稻米成分，而用其它谷物代替；而一些标注不含稻米成分的商品， 却可能添加了稻米成分。从谷物粉状食品中检测稻米成分是食品检测与监督执法的一项任 务。
[0003] 目前谷物粉状食品成分的检测方法主要包括：感官法、化学法和近红外光谱分析 法。
[0004] 利用感官法从不同谷物粉状混合物中准确鉴定稻米成分难度较大，存在人为判断 错误，不具有科学性和说服力。利用化学法检测谷物成分是利用不同的化学试剂和谷物成 分进行反应，从而对其成分进行检测和鉴定。谷物的化学成分一般都包括蛋白质、淀粉、月旨 类和无机盐等。不同种类的谷物具有相似的化学成分，所以利用该方法从谷物粉状混合物 中检测稻米成分灵敏性和特异性较差。近红外光谱分析法是目前较为常用的一种食品检测 方法。该方法虽能对谷物成分进行检测，但仪器要求较高，需要足够的专业知识建立模型才 能进行分析，较为复杂；此外，对于不同种类的谷物混合粉状样品而言，测定时存在的背景 干扰也可能会影响检测结果。
[0005] 依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，简称HDA)是由美国NEB公司于2004年发明一种核酸等温扩增技术。该技 术只需在恒定温度下进行，不需要温度变化的过程，因此，在实际操作和仪器要求方面，HDA 技术都比普通核酸扩增技术（PCR)更为简单和廉价，使样品的检测实现了快速、简便和高通 量，从而更容易被开发出检测的应用产品。
[0006] HDA技术原理是利用解旋酶在恒温条件下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白 (SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链，新合成的 双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实 现靶序列的指数增长。该技术的优点在于：等温扩增，HDA技术在一个恒定温度就能完成扩 增反应，不需要像普通PCR那样循环的温度变化；操作简便，HDA对引物的设计与普通PCR 相似，不需要复杂的引物设计，对于其他反应组分也不需要做任何特殊处理；设备简单，HDA 反应不需要复杂的设备，只需要一个简单的恒温器就可进行。因此，HDA技术具有广阔的应 用前景。
[0007] 目前尚未见利用HDA技术从谷物粉状食品中检测稻米成分的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有检测技术的不足，提供一种能够简单、准确、快速、高通 量的从谷物粉状食品中检测稻米成分的HDA检测方法及试剂盒。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供一种从谷物粉状食品中检测稻米成分的HDA引物 对，所述引物对序列为SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示的序列。
[0010] 本发明还提供一种试剂盒，即含有SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示的引物对 的试剂盒。
[0011] 本发明所述检测方法具体步骤为： 1、 从待测样品中提取DNA作为检测的模板； 2、 利用HDA引物对或者含引物对的试剂盒中的引物对，进行HDA反应，得到扩增产物； 3、 检测扩增产物，并作出判断。
[0012] 所述引物对序列为： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0013] 所述引物对由上海生工生物工程有限公司合成。
[0014] 所述的HDA反应体系为：5 yL的10 X缓冲液，0.2 μ mol的ATP，0.1 μ mol的 (11'011>8，10 11138七卩〇15〇116四86,5 48 1^。八蛋白，0.2 48 11￥扣]161;[。&86,25 4]\1海藻糖， 2 yL的10 ymol/L的上游引物，2 yL的10 ymol/L的下游引物，2 yL的样品基因组 DNA，用 CldH2O 补至 50 μ L。
[0015] 所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60-70°C恒温金属浴中恒温扩增2h。
[0016] 所述的检测扩增产物并作出判断是采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行，出现205 bp 左右的特异性扩增条带即判断为检测出稻米成分。
[0017] 本发明还提供了一种用于从谷物粉状食品中检测稻米成分的试剂盒。
[0018] 本发明所述用于从谷物粉状食品中检测稻米成分的试剂盒包括10X缓冲液， ATP，dNTPs，Bst polymerase，RecA 蛋白，UvrD heIicase，海藻糖，HDA 引物对，阳性对照 DNA 和 CldH2O0
[0019] 所述HDA引物对序列为： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0020] 所述引物对由上海生工生物工程有限公司合成。
[0021] 本发明的有益效果为：本发明的HDA引物对具有极高的特异性，仅能从稻米中扩 增出相应的特异性片段，可以对谷物粉状食品中的稻米成分进行检测，并且可以同时检测 大量样品，具有简单、准确、快速、高通量的特点。
[0022] 本发明引物对是通过分析已报道的水稻和其它谷物叶绿体基因基因序列设 计。
[0023] 使用本发明的引物对进行检测。谷类作物主要包括水稻、大麦、小麦、高粱、玉米、 大豆、薏苡等，因此分别购买每种谷物的5种不同生产厂家或者品牌进行检测。实施例1显 示，只有稻米特异性的检测出205 bp的扩增条带，其它谷物均未检测出205 bp的扩增条 带，准确率为100%。
[0024] 同时，从市场上购买10种不同的谷物粉状商品，使用本发明的引物对进行检测。 实施例2显示，含有稻米成分的谷物粉状商品可以检测出205 bp的特异性条带，而不含稻 米成分的谷物粉状商品没有检测出205 bp的扩增条带，检测结果与商品包装外的成分说明 相一致，准确率为100%。
[0025] 以上结果表明所提供的引物对具有很高的特异性、准确性和灵敏度，可用于谷物 粉状商品中稻米成分的HDA快速检测。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明HDA法检测不同谷物的试验结果图； 图2为本发明HDA法检测不同谷物粉状商品的试验结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明实施例中所使用的实验 方法如无特殊说明，均为本领域内常规方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以 通过商业途径获得的常规产品。
[0028] 引物对的设计： 根据水稻叶绿体基因序列（Genbank序列号：粳稻Crjza 5? ii ra 0rsajCp015;籼稻 Crjza saiira ca:0rsaiCp08;野生稻 Crjza p010,即SEQ ID No:3;SEQ ID No:4;SEQ ID No:5)和其它谷物叶绿体基因沒序列 (Genbank 序列号：HvsvCp012、TraeCp012、SobiCp012、ZemaCp013、GnpaC_p061、ColajoC_ P〇ll)设计得到，具体引物对序列如下： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0029] 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。
[0030] 引物对的合成和试剂盒的制备： 根据上述核苷酸序列信息由上海生工生物工程有限公司合成引物对； 将上述合成好的引物对分别配制成浓度为10 Mmol/L的溶液作为试剂盒，备用。
[0031] 以下实施例所述的上游引物rpoB-F即为SEQ ID No :1，下游引物rpoB-R即为SEQ ID No :2〇
[0032] 样品基因组DNA的提取(使用ZD Biotech植物种子DNA提取试剂盒提取检测样品 的基因组DNA ): 1) 取不同谷物样品液氮充分碾磨成粉末状。从中取约150 mg置于离心管中，加入600 KL ST溶液，涡旋震荡30 s至样品完全散开； 2) 加入10 PL RNase A以及10 PL蛋白酶Κ，漩涡混匀。37°C水浴30 min，并不断摇 动； 3) 12000 rpm离心2 min。取200 PL上清液移入新离心管中，加入200 PL溶液GL，上 下颠倒混匀。加入200 PL无水乙醇，上下颠倒混匀； 4) 将混匀液体移入离心柱中，12000 rpm离心I min。取出离心柱并弃去收集管中溶 液，将离心柱放回收集管中； 5) 向离心柱中加入550 PL溶液Wl。12000 rpm离心I min。取出离心柱并弃去收集 管中溶液，将离心柱放回收集管中； 6) 向离心柱中加入550 PL溶液W2。12000 rpm离心10 sec。取出离心柱并弃去收集 管中溶液，将离心柱放回收集管中。12000 rpm离心2 min; 7) 将离心柱取出并放入I. 5 mL离心管中。向柱中加入50 μL预热到50-60°C的灭菌 去离子水。静置2-3 min，12000 rpm离心I min。DNA溶液即被收集在离心管中。
[0033] 扩增反应与电泳检测： I) HDA反应体系和反应条件 以步骤3提取的基因组DNA为模板，进行HDA反应。
[0034] 反应体系为50 μL，即在0. 2 mL的PCR反应管中加入5 μ L的IOX缓冲液，0. 2 μ mol 的 ΑΤΡ，0.08 μ mol 的 dNTPs，10 U Bst polymerase，5 yg RecA 蛋白，0.2 yg UvrD 1161;^&86,25 4]\1海藻糖，2 41^的1〇41]1〇1/1^的上游引物印〇13-卩，2 41^的1〇41]1〇1/1^ 的下游引物rpoB-R，2 yL的样品基因组DNA，用CldH2O补至50 yL。
[0035] 所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60_70°C恒温金属浴中恒温扩增2h。
[0036] 2)扩增产物的电泳检测 用IXTAE电泳缓冲液制备1. 5%的琼脂糖凝胶。取扩增产物与5 μL IOX上样缓冲液 混合后，在已制备的琼脂糖凝胶的点样孔中进行点样。设置电压（3V/cm - 5V/cm)，电泳时 间为50 min - 60 min。用凝胶成像仪拍照记录。
[0037] 采用上述引物对特异性扩增的稻米基因片段长度为205 bp，根据检测样品 是否产生205 bp的扩增条带判定样品中是否含有稻米成分。
[0038] 3)从谷物粉状食品中检测稻米成分的HDA方法的确定 实验中所有谷物和粉状样品均来自大型超市或农贸市场，包含了谷物的主要种类：水 稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆和薏苡，每种谷物分别购买5种不同的生产厂家或者品牌。 同时，购买10种不同的谷物粉状商品，按上述方法分别提取基因组DNA，并进行HDA扩增，凝 胶电泳检测结果。凝胶电泳结果见图1和图2。图1显示只有稻米能够特异性检测出205 bp的扩增条带，其它谷物均未检测出205 bp的扩增条带，准确率为100%。图2显示，含有 稻米成分的谷物粉状商品可以检测出205 bp的特异性条带，而不含有稻米成分的谷物粉状 商品不能检测出205 bp的扩增条带，检测结果与商品包装外的成分说明相一致，准确率为 100% 〇
[0039] 图1中M均为DNA marker，1-5为水稻样品；6-10为小麦样品；11-15为大麦样 品；16-20为玉米样品；21-25为高粱样品；26-30为大豆样品；31-35为薏苡样品的HDA检 测结果。图2的泳道M为DNA marker，1-4为含有稻米成分的谷物粉状商品，5-10为不含 有稻米成分的谷物粉状商品的HDA检测结果。以上结果表明所提供的引物对具有很高的特 异性、准确性和灵敏度，应用所提供的方法可对谷物粉状商品中的稻米成分进行快速检测。
[0040] :1:5, -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' SEQ ID No:2:5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3' SEQ ID No:3:梗稻（Crjza saiira /apoflica)的 基因序列（Genbank 序列号： OrsajCpO15) ATGCTCCGGAATGGAAATGAGGGAATGTCCACAATACCCGG