用于在植物中诱导无融合生殖的改进的方法

用于在植物中诱导无融合生殖的改进的方法
【专利说明】用于在植物中诱导无融合生殖的改进的方法
[0001] 描述
[0002] 本发明涉及用于在植物中诱导无融合生殖的方法、用于产生无融合生殖植物的方 法以及由此获得的植物和植物种子。
[0003] 开花植物中的无融合生殖被定义为由胚珠的母本组织以无性方式形成种子，避免 了减数分裂和受精的过程，引起胚芽发育（Bicknell和K〇ltunow，2004)。因此，由以无融合 生殖方式形成的种子产生的植物与它们的祖代在基因上是相同的。一般来说，无融合生殖 的特征在于未减数的卵细胞在没有减数分裂的情况下产生（无减数无配子生殖），所述未 减数的卵细胞进行孤雌发育成胚芽，所述胚芽与母本植物在基因上是相同的。有性的一些 方面可以被维持，这是因为受精（即假受精）在很大程度上对于具有平衡的母本与父本基 因组比率的功能性胚乳（即胚芽的滋养组织）的产生来说是必要的。
[0004] 在植物中经由种子进行的自然发生的营养、非有性繁殖也被称作无融合生殖，是 主要存在于一些多倍体非栽培物种中的植物的遗传控制繁殖机制。各种类型的无融合生 殖，特别是配子体型和孢子体型可以被区分。在也被称为不定胚生殖的孢子体型无融合生 殖中，体细胞胚并不是从配子体发育，而是直接从珠心、子房壁或珠被的细胞发育。来自周 围细胞的体细胞胚侵袭有性子房，这些体细胞胚中的一个竞争过其它体细胞胚和有性胚 芽，并且利用所产生的胚乳。
[0005] 配子体型无融合生殖是无性种子形成的一种自然发生的类型，借此克隆母本基因 型的后代由未以减数分裂方式减数的胚囊，即雌配子体产生。大部分的配子体型无融合生 殖物种见于菊科（Asteraceae)、蔷薇科（Rosaceae)以及禾本科（Poaceae)中，其中它们已 独立地并且反复地出现。多倍性、兼性无融合生殖（一种个体内存在有性和无融合生殖种 子产生这两者）、以及无减数胚珠相对于有性胚珠的发育更快是这些分类群中的大多数之 间所共有的性状。
[0006] 无融合生殖源自于有性繁殖，并且对于有性植物来说必须取得以下三个独立的发 育步骤才能以无融合生殖方式产生种子：未减数的大孢子的形成，这意味着与母本植物的 体细胞具有相同的倍性的胚囊由未以减数分裂方式减数的大孢子（二倍性孢子形成、无减 数无配子生殖）或由珠心细胞（无孢子生殖）形成；在不存在受精的情况下随后由未减数 的卵细胞发育胚芽（孤雌生殖）；以及双核中央细胞受精以形成功能性胚乳（假受精）。术 语"无减数无配子生殖"涵盖了无孢子生殖和二倍性孢子形成这两者。以无减数方式产生 的胚芽因此经由母系接受它的整个基因组。由于这些组分处在独立的遗传控制下，因此很 难在考虑随机突变的情况下设想所有这三者如何可以在有性的祖代中一致地演化，这是因 为任何单个步骤的表达将降低它的有性载体的适应性。已被广泛接受的是，无融合生殖种 子发育由有性发育途径的失调所引起，所述失调将在多个基因座上同时表现。在野生的无 融合生殖分类群中，假设这种协调的失调受到由杂交和/或多倍性所引起的整体调节变化 的影响（Grossniklaus, 2001，从有性到无融合生殖：分子和遗传学方法（Fromsexuality toapomixis:Molecularandgeneticapproaches)，《无融合生殖的繁荣：从机制到遗 传工程化〉〉（Thefloweringofapomixis:FromMechanismstoGeneticEngineering) 中，168-211)。
[0007] 最近的报道在筷子芥属（Boechera)的显微解剖的胚珠中对无减数无配子生殖的 基因表达（意指未减数配子的形成）进行分析，并且能够在发育的特定阶段，即大孢子母细 胞（MMC)阶段鉴定出相当大量的在有性胚珠与无减数胚珠之间差异表达的等位基因。进一 步的研宄集中于在有性胚珠和无减数胚珠中在一系列的发育阶段期间基因表达谱的异时 性（Sharbel等人，2009,ThePlantJournal, 58, 870-882;Sharbel等人，2010,ThePlant Cell，22, 655-671)。然而，尽管现有技术预期地展示了通过特定的分子标记对无融合生殖 胚珠和有性胚珠进行表征，但它并未提供任何有关如何在所需的植物中以可靠的并且可预 见的方式，特别是借助于常规的基因转移技术来诱导无融合生殖的提示。
[0008] 实际上，在鉴定控制无融合生殖的分子遗传机制中的主要困难之一在于几乎所有 的无融合生殖体的基因组均具有多倍性和杂合性这两种性质。尽管已付出了相当大的努 力，包括深入的功能性分子分析，来分析无融合生殖现象的根本分子体制，但迄今为止以单 独地对任一种效应的影响进行控制仍然是一项挑战，这两者都可能具有不同的调节后果。
[0009] 针对可控制的更可再现的性状对无融合生殖进行工程化将在植物改良和栽培品 种开发中提供许多优势。无融合生殖将提供纯育、种子繁殖的杂种。控制无融合生殖因此 将极大地有助于并且促进植物育种人员固定并且可靠地繁殖作物植物中的遗传杂合性和 相关的杂种优势的能力。此外，无融合生殖可以缩短并且简化常规的育种过程，以使得可以 避免自体受精和后代测试以产生理想的基因组合或使理想的基因组合稳定。
[0010] 无融合生殖的受控使用因此必然将简化商业杂种种子生产。具体来说，将消除对 物理隔离商业杂种生产场地的需要，可供使用的陆地均可以被用于使杂种种子生长而不是 在授粉媒介与雄性不育系之间隔开，并且最终将消除维持亲本系种子储备的需要。
[0011] 无融合生殖将提供具有独特的基因组合的基因型作为栽培品种的用途，这是因为 无融合生殖基因型是纯育的而与杂合性无关。基因或基因的群组因此可以在超级基因型中 被固定。来自有性-无融合生殖杂交的每一种优越的无融合生殖基因型均有可能成为栽培 品种。无融合生殖因此将允许植物育种人员针对诸如高度、种子和饲草质量以及成熟之类 的特征开发出具有特定的稳定性状的栽培品种。
[0012] 因此，无融合生殖在农业中的应用被认为是一种重要的使能技术，它将 极大地有助于作物植物中的遗传杂合性和相关的杂种优势的固定和可靠的繁殖 (Spillane, 2004,NatBiotech22(6), 687-691)〇
[0013] 然而，所有这些依赖于经由无融合生殖来生产种子的潜在益处目前均在很大程度 上由于将无融合生殖能力工程化到所关注的植物中的问题而尚未实现。
[0014]US2002/0069433A1公开了用于提高新一代植物的营养繁殖概率的方法，其中以 转基因方式使编码在由体细胞胚芽发生受体激酶触发的信号转导级联中起作用的蛋白质 的基因表达。US2008/0155712A1公开了用于在植物，特别是玉米中鉴定，特别是通过基因 组定位来鉴定负责无融合生殖发育的序列的方法。W0 99/35258A1公开了来自狼尾草属 (Pennisetum)的无孢子生殖特异性基因组区域的核酸标志物。US7,541，514B2公开了由 有性植物通过对特定的植物品系进行选择、采集以及育种而产生无融合生殖植物的方法。
[0015] 所述公开内容都没有提供可以容易用于基因转移方法中以可控制的并且低成本 的方式在植物中获得无融合生殖的方法。
[0016] 本发明的根本技术问题因此在于提供克服上文所示的问题的方法，特别是提供例 如借助于重组基因技术，特别是借助于重组DNA转移技术将无融合生殖引入到植物中的方 法，特别是提供在植物中，特别是以可控制的、可预见的、可靠的、容易的并且有成本效益的 方式诱导无融合生殖以及获得无融合生殖植物的方法。
[0017] 本发明通过提供独立权利要求的教导，特别是通过提供在植物中诱导无融合生殖 的方法、产生无融合生殖植物的方法以及由此获得的植物来解决它的根本问题。
[0018] 因此，本发明涉及用于产生转基因无融合生殖植物的方法，所述方法包括下列步 骤：
[0019]a)提供植物细胞，
[0020] b)将所述植物细胞用含有至少一种外源性核苷酸序列元件的至少一种植物载体 转化以获得转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含所述至少一种外源性核苷酸序列元 件并且所述转基因植物细胞包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用 调节元件以及在所述顺式作用调节元件控制下的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白 质的核苷酸序列，其中所述反式作用无融合生殖效应子能够与所述顺式作用调节元件相互 作用并且其中所述顺式作用调节元件包含选自以下的至少一种调节核苷酸核心序列：
[0021] SEQIDNo. 66或67中的任一个的ATHB-5结合位点、SEQIDNo. 68至73中的任 一个的UM-1结合位点、SEQIDNo. 74或75中的任一个的S0RLIP1AT结合位点、SEQID No. 76或77中的任一个的S0RLIP2AT结合位点、以及SEQIDNo. 78或79中的任一个的 P0LASIG1结合位点，以及
[0022] c)使所述转化的植物细胞再生成表现出无融合生殖的转基因植物。
[0023] 因此，本发明提供了用于产生转基因无融合生殖植物的方法。这些方法包括一系 列工艺步骤a)、b)以及c)，在优选的实施方案中由一系列工艺步骤a)、b)以及c)组成。 进行所述工艺步骤a)、b)以及c)还适合于在植物中诱导无融合生殖。因此，本发明还涉及 用于在植物中诱导无融合生殖的方法，所述方法特别是由上文所示的步骤a)、b)以及c)组 成，包括上文所示的步骤a)、b)以及c)。对于这样的教导，本发明的下列技术考虑因素均 适用，并且对于本领域技术人员来说是明显的。
[0024] 本发明的方法教导了提供植物细胞，特别是来自有性繁殖植物的植物细胞，以及 将所述植物细胞用含有至少一种外源性核苷酸序列元件的至少一种植物载体转化以获得 转基因植物细胞，所述转基因植物细胞意指除了步骤a)中所提供的植物细胞中内源性地 存在的遗传物质之外，植物细胞还包含至少一种外源性核苷酸序列元件，所述至少一种外 源性核苷酸序列元件因此在步骤a)中所提供的所述植物细胞中并不天然存在或并不天然 存在于特定的基因组位置处。通过植物载体被转移到植物细胞中的所述至少一种外源性核 苷酸序列元件是编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用调节元件，特别 是启动子，最优选地含有调节核苷酸核心序列的启动子，或包含这两者。在优选的实施方案 中，所述外源性核苷酸序列元件包含与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸 序列功能性地并且可操作地连接的顺式作用调节元件。经过所述载体转化的转基因植物因 此接受被稳定地整合到它的基因组中的所述至少一种外源性核苷酸序列元件。
[0025] 在工艺步骤b)中所获得的转基因植物细胞包含编码反式作用无融合生殖效应子 的核苷酸序列、顺式作用调节元件以及编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸 序列，其中所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列处在所述顺式作用 调节元件的调节控制下，特别是在转录控制下，并且其中至少编码反式作用无融合生殖效 应子的核苷酸序列或任选地与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列可 操作地连接的顺式作用调节元件已在工艺步骤b)中被转化到所述植物细胞中。因此，这两 种上文所示的核苷酸序列中的至少一种是被引入到所要转化的植物细胞中的外源性核苷 酸序列。
[0026] 反式作用无融合生殖效应子在特别优选的实施方案中是反式作用转录因子，特别 是DNA结合转录因子。
[0027] 在本发明的优选的实施方案中，用于转化步骤（a)中所提供的植物细胞的植物载 体包含编码所述反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列或包含所述顺式作用调节元件 的核苷酸序列或这两者作为外源性核苷酸序列元件。因此，本发明假定作为在步骤b)中通 过转化植物细胞所获得的转基因植物细胞的特征的外源性核苷酸序列元件是编码反式作 用无融合生殖效应子的核苷酸序列或包含顺式作用调节元件，特别是本发明的所谓的"调 节核苷酸核心序列"的核苷酸序列，或这两者。在一个特别优选的实施方案中，在所述植物 载体含有顺式作用调节元件的情况下，它还包含与所述顺式作用调节元件可操作地连接的 具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列。因此，工艺步骤b)的当前所获得的转 基因植物细胞的特征在于存在转基因核苷酸序列，所述转基因核苷酸序列包含反式作用无 融合生殖效应子、转基因顺式作用调节元件，特别是本发明的调节核苷酸核心序列，或这两 者，并且其中所述核苷酸序列并非内源性地存在于步骤a)中所提供的植物细胞中或并非 存在于在转化步骤之后所实现的所述特定的基因组位置处。
[0028] 本发明的教导是基于本申请的发明人的以下贡献：在转化的植物细胞中，特别是 以增加表达的方式，提供本发明的特定的反式作用无融合生殖效应子允许在植物细胞中诱 导无融合生殖表型。因此，在本发明的一个实施方案中，假定将所述植物细胞用至少一种植 物载体转化，所述植物载体包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列，所述核苷 酸序列优选地处在调节序列，特别是强组成型或诱导型启动子的控制之下，特别是允许表 达与野生型表达相比有所增加。因此，这种编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列 在植物细胞中被转化、整合并且表达之后将优选地允许表达有所增强或改良以及产生反式 作用无融合生殖效应子，以允许，在优选的实施方案中连同与编码具有DEDDh核酸外切酶 活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的顺式作用调节元件一起允许所需的无融合生 殖表型产生。优选地与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连 接的顺式作用调节元件可以是内源性存在的核苷酸序列或可以是外源性转基因核苷酸序 列元件本身。
[0029] 在一个实施方案中，本发明的包含至少一种调节核苷酸核心序列的优选地与DEDDh核酸外切酶可操作地连接的特定的顺式作用调节元件的引入引起所述核酸外切酶在 通过本发明获得的转基因植物的胚珠中表达并且从而为本发明的植物提供了无融合生殖 表型。本发明因此教导了特定的反式作用无融合生殖效应子与特定的顺式作用调节元件， 特别是本发明的调节核苷酸核心序列的特定的相互作用。
[0030] 本发明基本上是基于代表所谓的apollo基因的核酸分子或其必要的和特定的部 分，所述apollo基因意指"无融合生殖相关基因座(Apomixislinkedj^cus) "。所述基因， 特别是它的编码序列对apollo蛋白质进行编码，所述apollo蛋白质在植物胚珠中表达后 会引起无融合生殖种子产生。
[0031] 本发明有利地使用了呈分离和纯化形式的多核苷酸，特别是编码能够在植物中诱 导无融合生殖的蛋白质，即apollo蛋白质，的多核苷酸，以及能够充当所述编码序列的调 节元件的多核苷酸。此外，本发明是基于以下教导：植物，特别是它们的基因组内源性地包 含编码所述能够诱导无融合生殖的apollo蛋白质的核苷酸序列，在下文中也被称为"多核 苷酸"或"多核苷酸序列"以及它的调节元件，在下文中也被称为"内源性地存在编码能够在 植物中诱导无融合生殖的蛋白质的多核苷酸"。因此，例如以SEQIDNo. 37、40、43、46、49或 52所指定的编码序列和调节序列这两者通常以各种等位基因状态内源性地存在于它们在 植物中，特别是十字花科（Brassicaceae)，优选地筷子芥属中的天然和原始的基因组环境 中，并且引起有性或无融合生殖表型在植物中的产生。然而，在天然存在的有性繁殖的植物 中，所述核苷酸序列（呈它们的有性等位基因状态，在下文中也被称作"有性等位基因"）， 如SEQIDNo. 46、49或52中的核苷酸序列在所述植物的胚珠中受到阻遏、抑制、或未被激 活、或失活（这意指不表达），从而阻止无融合生殖。相比之下，所述多核苷酸（呈它的无融 合生殖等位基因状态，在下文中也被称作"apo等位基因")，如SEQIDNo. 37、40或43中的 多核苷酸在无性繁殖的植物的胚珠中被诱导或去阻遏、或并未失活，这意指表达，所述植物 意指无融合生殖植物。
[0032] 具体来说，本发明是基于如下的教导：在有性繁殖的植物的植物胚珠中，内源性存 在的编码具有无融合生殖诱导能力的apollo蛋白质的基因在所述组织中被抑制、阻遏、未 被激活、或失活，并且因此需要被