基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因编码荧光探针及其制备方法 和应用。一方面本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的检测探针，具体涉及还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在又一方面，本发明也涉及 上述检测探针的制备方法及其在检测NADPH中的应用。
【背景技术】
[0002] 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)是体内重要的辅酶之一，它不仅参与 了细胞内的脂类、脂肪酸和核苷酸等物质的合成代谢反应并为该反应过程提供还原力；还 通过重生还原型谷胱甘肽，硫氧还蛋白等抗氧化物质维持着细胞内的氧化还原势；另外它 也可以通过细胞色素 P450蛋白等参与细胞的去毒反应，降解细胞内的毒性物质；除此之 外，它还可以通过NADPH氧化酶产生活性氧类（R0S)，调苄基因表达、细胞内信号转导和免 疫反应等（Agledal，L.等，Redox R印.2010, V. 15(1)，PP. 2-10)。因此，NADPH 和细胞代谢、 氧化还原代谢和细胞内信号转导等生命过程有紧密的关系，而与NADPH代谢相关的众多酶 类也成为了药物设计的靶标（R〇hle，D.等，Science. 2013, V. 340(6132) :，PP. 626-630)。
[0003] 但是，大多数细胞内游离的NADPH含量非常低，Ig湿重的小鼠肝脏大约含 有0.1 ymol的NADP(H)，其中绝大部分都是以结合形式存在的（Reiss，P.D.等，Anal Biochem. 1984, V. 140(1)，pp. 162-171)。在不同细胞类型和亚细胞器中，游离的NADPH和 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)的比例略有变化，例如线粒体中的游离NADPH和NADP 的比例通常高于10:1，而在细胞胞浆中还原状态的NADPH甚至占到了游离NADP(H)部分的 99% 左右（Veech，R.L.等，Biochem J. 1969, V. 115 (4)，pp. 609-619)。早期的紫外分光光度 法是利用NADPH的光吸收性质，但是该方法的灵敏度很差且不能有效地区分还原型烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸（NADH)与NADPH。随后发展的酶学方法是依据NADP +和NADPH可以在酶作 用下互相转化的性质，但是这种检测方法受到外界环境，酶的活性以及分析仪器的灵敏度 限制。另外还有一些物理化学检测方法，如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳等，虽然它们 的精度较高，但是在活细胞研究中存在很大的缺陷。它们需要经过耗时的样品处理时间(细 胞破碎、分离提取纯化等)，而NADPH在环境中非常容易氧化，因此这些方法不能应用于细 胞或活体动物的实时准确地检测。这些检测方法测量的是细胞群体，掩盖了细胞之间的差 异，限制了它们在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前虽然存在检测NADH和 NADH:NAD+ 比例的基因编码荧光探针（Zhao, Y.等，Cell Metabolism. 2011，V. 14(4)，pp. 55 5-566)，但是它们依然存在荧光强度低，动态变化范围小以及不合适于线粒体检测等劣势， 最为重要的是它们不能用于细胞内NADPH的检测。
[0004] 虽然目前可以利用自发荧光的方法在细胞或活体上进行NADPH的实时检测，但是 这种方法存在严重的局限性：首先，不能有效的区分NADH与NADPH，由于它们的荧光光谱 完全相同，因而检测的信号是NADH与NADPH总量之和；另外游离的NAD(P)H含量很低，所 以测量的NAD(P)H的自发荧光信号，反映的其实是蛋白质结合的NAD(P)H的荧光（Zhang. Q. Η·等，Science. 2002, V. 295 (5561)，ρρ· 1895-1897);其次，NADPH 的激发波长位于近紫外 区（340nm)，它的穿透力很弱且长时间照射会造成严重的细胞损伤，用于自发荧光检测的仪 器价格也非常昂贵，这些局限性都制约了该方法在活细胞中的应用。因此，本研究领域亟需 发展一种特异性检测NADPH的技术，特别是适合于生理水平的时空特异性检测NADPH的技 术。
[0005] 相对于传统的小分子化学染料以及迅速发展的量子点检测技术，基因编码的荧光 蛋白探针在活细胞成像方面具有很大优势。基因编码的荧光蛋白探针存在光毒性小、可以 基因编码，并能够通过基因操作的方法在细胞、组织乃至整个器官中进行表达，因此荧光探 针是优异的单细胞代谢小分子的实时指示器。基因编码的荧光蛋白探针是由荧光蛋白和对 配体特异性结合的支架蛋白组成的。
[0006] 最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID N013)，它是从维多利亚发光水 母（Aequorea victoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由 11条β -折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)。当在 氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生 荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm 的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光 (Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, V. 91 (26)，PP. 12501-12504)。随着对 GFP 蛋白突变的研究不断深入，目前产生了很多不同颜色的突变体例如荧光增强型绿色荧光蛋 白（eGFP)、黄色荧光蛋白（YFP)、青色荧光蛋白（CFP)、蓝色荧光蛋白（BFPSeq ID N014)， 绿色荧光蛋白（TFP)等。除此之外，科学家还在海洋珊瑚中发现了第一种红色荧光蛋白 (RFP)，经过不断的改造产生了多种商业化的红色荧光蛋白突变体，其中最常用的红色荧光 蛋白，一种是搜桃红突光蛋白mcherry(Seq ID N015)，它的激发峰在587nm，发射峰在621nm (Tsien，R.Y.等，Nat Methods. 2008, V. 5(6)，ρρ· 545-551);另一种是mKate(Seq ID N016)， 它的光谱和 mcherry 类似（Shcherbo，D.等，Nature Methods. 2007, V. 4(9)，ρρ· 741-746) 等。
[0007] 基因编码的荧光探针的主要构建方式是荧光共振能量转移（FRET)和基于单生色 团的荧光蛋白，其中后者的主要形式是天然荧光蛋白质的环状重排。例如将GFP的原始N 端和C端通过一段柔性的短肽链连接，而在野生型GFP近生色团位置(如Y144和N145位氨 基酸)制造一个新的N端和C端，就可以形成一个对空间构象变化非常敏感的环状排列荧光 蛋白（circularly permuted fluorescent protein)。目前已经创造了多种环状重排的突 光蛋白（cpFP)用于荧光探针的构建，如环状重排蓝色荧光蛋白（cpBFPSeq ID N08)，环状重 排绿色荧光蛋白（cpEGFPSeq ID N07)，环状重排黄色荧光蛋白（cpYFPSeq ID N06)，环状重 排绿色荧光蛋白（cpTFPSeq ID N09)，环状重排橙色荧光蛋白（cpmOrange Seq ID N010)， 环状重排苹果红突光蛋白（cpmAppleSeq ID N011)，环状重排红色突光蛋白（cpmKateSeq ID N012)等（Zhao, Υ·等，Science, 2011，V333 (6051)，ρρ· 1888-1891)，其中 cpYFP 在荧光 探针的构建和应用中非常普遍（Nagai，Τ·等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，V. 98 (6)， ρρ· 3197-3202)。
[0008] 本技术中用于对NADPH进行表现的多肽来源于嗜热水生菌（Thermus Aquaticus) 的Rex蛋白（T-Rex)，它是由ydih基因编码（Seq ID N01)。Rex蛋白是一种广泛存在于革 兰氏阳性菌中并对细菌氧化还原势敏感的转录调控因子，分子量约为23kDa，它能调控发酵 和厌氧呼吸（Sickmier，E.A.等，Structure, 2005, V13(l), PP. 43-54)。不同种属的 Rex 蛋 白结构非常类似，它们都是由NAD (P) H结合域和DNA结合域组成的同源二聚体，其中NAD⑵ H结合域是典型的Rossmann结构域，它可以结合辅因子NAD (H)，NADP (H)及其类似物ATP 等，但是它对NAD (H)的亲和力强于NADP (H)，因此天然的Rex蛋白在细胞内主要感应胞质 NADH和NAD+比率的变化，在NADH和NAD+比率动态变化的过程中Rex蛋白的空间构象也会 发生很大改变（Brekasis，D.等，EMBO J. 2003, V. 22(18)，PP. 4856-4865)，因此，Rex 蛋白 是一个很好的细胞内NADH及其类似物检测探针的候选者，而我们可以通过对Rex蛋白进行 理性突变改造，产生一个对于NADPH响应的多肽用于探针构建。
[0009] 将理性突变获得的对NADPH特异性结合而对NADH不敏感的Rex蛋白突变体和环 状重排的荧光蛋白（cpFP)进行融合并改造，可能会筛选获得新型的基因编码的NADPH荧光 探针。理论上，对NADPH特异性结合的Rex蛋白突变体可以感受环境内NADPH的浓度变化， 并将这一构象变化传递至临近的环状重排的荧光蛋白，通过对荧光变化的测量，就可以对 环境中NADPH的浓度改变进行实时且直观地描述。
[0010] 综上所述，我们认为利用包含理性突变的Rex蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足 在生理水平和亚细胞水平上检测NADPH的迫切需要。
[0011] 不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明 的现有技术。
【发明内容】
[0012] 为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针。
[0013] 本发明的第二个目的是提供编码基因编码的NADPH荧光探针的核苷酸序列。
[0014] 本发明的第三个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针的制备方法。
[0015] 本发明的第四个目的是提供包含基因编码的NADPH荧光探针的融合蛋白。
[0016] 本发明的第五个目的是提供编码含有NADPH荧光探针的融合蛋白的核苷酸序列。
[0017] 本发明的第六个目的是提供包含编码NADPH荧光探针核苷酸序列的表达载体。
[0018] 本发明的第七个目的是提供包含本发明所述表达载体的宿主细胞。
[0019] 本发明的第八个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针在检测NADPH或筛选药物 中的应用。
[0020] 本发明的第九个目的是提供一种试剂盒，其包含本发明所述的基因编码的NADPH 荧光探针和说明书。
[0021] 本发明的技术方案如下：
[0022] 本发明提供基因编码的NADPH荧光探针，包括：对NADPH敏感的多肽B和对NADPH 进行表现的荧光蛋白A ;所述对NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用导致荧光蛋白A荧 光强度的变化。
[0023] 根据本发明所述的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，来源于对NADH敏感的 嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白的突变体，所述T-Rex蛋白如SEQ ID NO :2所示，所 述突变体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位，112-116位，130 位，148位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B，优选如SEQ ID NO :30-44所示；或
[0024] 与来源于对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白同源性高达90% 以上的氨基酸序列，所述T-Rex蛋白如SEQ ID N02所示，如来源于Thermus oshimai JL-2 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :3 所不，来源于 Marinithermushydrothermalis DSM14884 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :4 所不，来源于 Deinococcusproteolyticus MRP 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :5所示等，所述突变是在NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位进行突变。
[0025] 本发明所述对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白的突变体，突变 体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B，其中112-116位氨基酸组成了 NAD)H结合口 袋，其112-114位的突变可以为T/S112, R113, T/S/K114,而115-116位的突变可以为P/ A115&Q116或G/A/P115&E116 ;而90-91位，130位，148位为结合口袋三维结构上临近的氨 基酸，可以调节多肽B结合NAD⑵H的亲和力，其突变可以为D90, K/R91，V/T/Y130或V/A/ T148。
[0026] 本发明对NADPH敏感的多肽B可以来源于和嗜热水生菌T-Rex蛋白同源性在90% 以上的其他嗜热菌Rex蛋白突变体，它们的关键氨基酸90-91位，112-116位，130位，148 位氨基酸于T-Rex蛋白相同或者性质相似，如来源于Thermus oshimai JL-2的Rex蛋白如 SEQ ID NO :3 所不，来源于 Marinithermushydrothermalis DSM14884 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :4 所不，来源于 Deinococcusproteolyticus MRP 的 Rex 蛋白如 SEQ ID NO :5 所不等。
[0027] 根据本发明所述的基因编码的NADPH荧光探针，进一步优选的是，所述的对NADPH 敏感的多肽B来源于对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白突变体，所述 T-Rex蛋白如SEQ ID NO: 2所示，所述突变体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键 氨基酸90-91位，112-116位，130位，148位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B的 DNA结构域的截短体(如SEQ ID NO :45-54所示）。
[0028] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针的组合形式是对 NADPH进行表现的荧光蛋白A插入到对NADPH敏感的多肽B中，将B分为两个部分，B的第 一部分Bl和B的第二部分B2,形成的探针结构式B1-A-B2 ;所述荧光蛋白A的插入位点 是对 NADPH 敏感多肽 B 的 79/80,99/100,112/113,112/114,166-167,187/188,188/189， 189/190,187/189,187/190,188/190位，或者其家族蛋白的对应氨基酸位点。
[0029] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述荧光探针的组合 形式是对NADPH进行表现的荧光蛋白A插入到对NADPH敏感的T-Rex蛋白的突变体多肽B 中，将B分为两个部分，B的第一部分Bl和B的第二部分B2,形成的探针结构式B1-A-B2 ;所 述荧光蛋白A的插入位点是对NADPH敏感的T-Rex蛋白的突变体多肽B的79/80,99/100， 112/113,112/114,166-167,187/188,188/189,189/190,187/189,187/190,188/190 位，或 者其家族蛋白的对应氨基酸位点。
[0030] 本发明所述荧光蛋白A的插入位点，进一步优选的是对NADPH敏感的T-Rex蛋白 的突变体多肽 B 的 112/113,112/114,188/189,189/190 (如 SEQ ID NO :55-58 所示）。
[0031] 本发明所述基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述对NADPH敏感的多肽B含 有关键氨基酸突变体的DNA结合域截短体78-212,如SEQ ID NO :45-54所示。
[0032] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋 白A选自：维多利亚水母的环状变换的绿色荧光蛋白的突变体cpGFP如SEQID NO :7所示及 其同源突变体蓝色荧光蛋白cpBFP如SEQ ID NO :8所示、黄色荧光蛋白cpYFP如SEQ ID NO :6所示、绿色荧光蛋白cpTFP如SEQID NO :9所示，和/或来自于海洋珊瑚的红色荧光 蛋白及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：环状重排橘黄色荧光蛋白如SEQ ID NO :10 所示、环状重排苹果红突光蛋白cpmApple如SEQ ID NO :11所示、环状重排红色突光蛋白 cpmKate 如 SEQ ID NO :12 所不；等。
[0033] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋 白A，优选的是，来自于维多利亚水母的环状变换的绿色荧光蛋白的突变体如SEQ ID NO: 6-9所示。
[0034] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋 白A，进一步优选的是，来自于维多利亚水母的环状变换的黄色荧光蛋白cpYFP如SEQID NO :6所示。
[0035] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，对NADPH敏感的多肽B和对NADPH 进行表现的荧光蛋白A之间可直接或通过柔性氨基酸操作性连接；所述柔性氨基酸是甘氨 酸，丙氨酸，苏氨酸，丝氨酸；所述柔性氨基酸的数目，优选的是不超过5个（SEQ IDN059); 所述柔性氨基酸的数目，进一步优选的是不超过4个（SEQ IDN060);所述柔性氨基酸的数 目，更优选的是不超过3个（SEQ IDN061-62);所述柔性氨基酸的数目，最好是氨基端的数目 为3个，羧基端的数目1个（SEQIDN063)。
[0036] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针的氨基酸序列为： SEQ ID NO :67-69。
[0037] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述荧光探针的氨基 酸序列 SEQ ID NO :90-109。
[0038] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针由SEQ ID NO : 64-66所示的基因编码。
[0039] 根据本发明提供的优选基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针由SEQ ID NO : 70-89所示的基因编码：。
[0040] 根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，本发明还提供和编码所述荧光探 针的核苷酸序列互补的核酸序列。
[0041] 本发明还提供一种融合蛋白，将所述的NADPH荧光探针作为基本单位，在其N端和 /或C端融合其他多肽；该融合蛋白不影响所述的NADPH荧光探针的性质，用于扩大所述的 NADPH荧光探针的应用，所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括定位到 不同亚细胞器的信号肽、用于纯化或者免疫印迹的标签、荧光蛋白或以NADP (H)为辅酶的