一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及葡萄酒酿造领域，具体地，涉及一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛 选方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄酒是指以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，人工或天然接种酵母菌后，将糖全部或 部分发酵转化成乙醇的饮料酒。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是占 主导地位的微生物。葡萄酒的酒精发酵主要是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的 作用下，采用自然发酵、纯种发酵或混合发酵，将葡萄汁中的营养成分转化成酒精和其他风 味物质的过程。除了酿酒酵母外，在葡萄汁自然发酵的前期和中期还存在着很多不同种属 的非酿酒酵母类酵母。这些微生物中的某些种已被证明在葡萄酒酿造初期，甚至发酵中期 存在较大数量，起到诱发酒精发酵的作用，并且对葡萄酒的香气、风味产生重大影响，但在 酒精发酵后期，非酿酵母的种类和数量都急剧下降。因此，可以将酿酒酵母对酒精和SO 2的 抗性能力作为与其它酵母菌株进行区分的初步筛选依据之一。
[0003] 酒精发酵结束后，绝大多数葡萄酒需要继续进行苹乳发酵，以将口味酸涩的苹果 酸转化为口感柔和的乳酸和二氧化碳。在这一过程中乳酸菌起到了不可替代的作用。在 苹乳发酵自然启动的葡萄酒中，存在不同种类的耐受高浓度乙醇乳酸菌，如酒类酒球菌 (Oenococcus oeni)、植物乳杆菌和乳酸片球菌等。其中酒类酒球菌往往是最占优势的菌 群。但是，自然条件下引发的苹乳发酵却存在着极大的不确定性，有时会造成发酵迟滞甚至 停止，进而造成酒质败坏，甚至产生生物胺和氨基甲酸乙酯等有害物质。因此，在酒精发酵 结束的葡萄酒中，人工接种适当的乳酸菌是目前经常采用的方法。在大多数经过商业化生 产的苹乳发酵剂菌株中，酒类酒球菌最为常见。
[0004] 据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV)统计，2012年全世界葡萄酒消费总量约为247. 2 亿升至2547亿升。进入新千年后，中国葡萄酒产量一直保持两位数的增幅。2012年，全国 葡萄酒的产量约为22亿升，同比增长16. 9%。但是，我们不得不承认，如此之大的葡萄酒产 量，却几乎全部由进口葡萄酒发酵剂酿造而成。目前世界比较著名的葡萄酒产地，如法国、 西班牙、意大利等国非常重视本土优良葡萄酒酿造菌种的选育和特性研究，使得这些国家 的发酵剂在世界上广受欢迎，享有很高的声誉，同时也给这些国家带来了巨大的经济和社 会效益。而中国在这方面的发展则相对滞后，至今国产葡萄酒发酵剂在市场上仍十分罕见， 这使得我国国产葡萄酒缺乏产地特色，与外国进口葡萄酒同质化问题严重，限制了国产葡 萄酒的发展。此外，由于葡萄品种、栽培环境及工艺条件等差异，引入菌种并不能完全表现 出其良好品质，这样会导致国产葡萄酒质量不稳定，给葡萄酒企业带来不同程度的经济影 响。造成国产葡萄酒发酵剂研究一直滞后的重要原因是传统手工筛选方法的工作量大、研 发周期长，需要耗费大量人力、物力和时间。
[0005] 无论是早期的自然发酵还是现代的人工接种发酵，葡萄酒酿造均是一个复杂的微 生态环境演替过程，酵母菌和乳酸菌之间存在着相互影响，并对葡萄酒的风味起着不同作 用。在葡萄酒酿造过程中，高浓度的糖或乙醇含量使酵母和乳酸菌只有通过发酵途径进行 代谢。例如，在酿酒酵母酒精发酵生成乙醇和CO2的同时，还可将葡萄汁中一少部分的糖份 (约8%)通过甘油丙酮酸途径（glyceropyruvic pathway)转化为甘油和丙酮酸；酵母细胞再 将丙酮酸转化为种类繁多且含量很低、但对葡萄酒风味产生重大影响的副产物，如有机酸、 酯类、醛类和高级醇等。因此，选用不同的发酵剂菌株在相同条件下用同一种葡萄酿造出来 的葡萄酒是不同的，有些差别更是极为显著。根据这些微生物在代谢框架上的差异，可以对 这些葡萄酒酿造用菌株进行差异化区分。
[0006] 葡萄酒酿造用微生物筛选的目的就是在酒精发酵过程中使葡萄汁中的糖分有效 地转化为酒精并酿造出优质的葡萄酒，而在苹乳发酵过程中将苹果酸转化为乳酸。如果酿 酒工艺中所用发酵菌株不适合于葡萄酒酿造或在酿造特性上存在重大缺陷，会使酿出的葡 萄酒品质低下，导致顾客满意度下降，进而造成重大经济损失。在葡萄酒酿造用微生物筛选 研究领域是有一系列为国际所公认的筛选标准可供参考的，主要是依据酿造优质葡萄酒所 需特性进行判断，并经过数年的酿造研究最终确定是否具有成为商业菌株的潜力。一般情 况下，在筛选过程中，葡萄酒酿造用微生物的特性主要分为两类：（1)影响酒精发酵进程的 特性，即工艺特性（technological characteristics) ; (2)决定葡萄酒最终质量和风格的 特性，即品质特性（qualitative characteristics)。
[0007] 酿酒酵母的工艺特性影响着发酵的效率和进程。快速且完全的利用葡萄汁中糖类 并产生高含量的乙醇（>8%，v/v)是葡萄酒酿酒酵母最重要的工艺特性。葡萄酒酿造过程中 的各种逆境条件使得发酵菌种必须具有对这些逆境的抵抗能力，比如对高初始糖含量、高 酒精含量、高SO 2浓度和高Cu2+浓度具有抗性，并且具有一定抗氧化能力和对温度变化的适 应能力。此外，葡萄酒用酿酒酵母还应具有泡沫产量低、产酶特性及在发酵过程中分散性好 而发酵结束后沉降速度快等技术特性。
[0008] 酿酒酵母的品质特性决定所酿葡萄酒的化学成分并影响着酒体的感官特征。因 此，酿酒酵母的质量特性是可以利用检测手段进行定量测定的。优良的葡萄酒酿酒酵母产 生一系列组分平衡的风味代谢物，如甘油、琥珀酸、酯类及高级醇等挥发性香气物质，且任 何一种对葡萄酒风味(如乙酸、乙酸乙酯、H 2S、SO2、乙醛等）或安全性(氨基甲酸乙酯、生物 胺）不利的物质的产量都不超过限值，并且赋予葡萄酒优雅的色泽及复杂的口感。
[0009] 对于苹乳发酵微生物，对高乙醇浓度、低温、SO2、低pH及噬菌体具有抗性，在苹乳 发酵过程中能够快速启动并完成发酵，在发酵过程中不产生生物胺和氨基甲酸乙酯，同时 在苹乳发酵过程中能够产生2, 3- 丁二醇等对葡萄酒风味起促进作用物质等都属于苹乳发 酵菌株重要的工艺特性。在苹乳发酵过程中，由于乳酸菌自身存在的酯酶、葡萄糖苷酶等酶 类，可以产生一些对葡萄酒风味有促进的物质，这些则属于苹乳发酵发酵剂的品质特性范 畴。
[0010]目前，科研工作者对葡萄酒酿造用微生物的筛选目标主要集中在以下五个方面： [0011] (1)改良发酵性能。如提高碳、氮源的利用率，提高对逆境的抗性，降低泡沫产量 等。
[0012] (2)提高加工效率。如选育各种胞外酶(蛋白酶、葡萄糖苷酶和果胶酶等)产量较高 的菌株以利于提升葡萄酒的品质或促进葡萄酒的澄清；在特殊工艺要求下筛选具有促进沉 淀、悬浮及成膜等表面特性菌株；筛选或构建可以将酒精发酵和苹乳发酵同步进行的菌株。
[0013] (3)不产生对人体有害的物质。如生物胺和氨基甲酸乙酯等。
[0014] (4)提高保健功能。如降低乙醇产量，降低产生生物胺和氨基甲酸乙酯的可能性， 提商白黎芦醇的广量等。
[0015] (5)提1?感官品质。提1?菌株释放匍萄中帖类物质及挥发性硫化物的能力，提1?甘 油及重要酯类物质的产力，减少乙酸的产量，增加或降低葡萄酒的酸度。
[0016] 优良的发酵菌株是酿造优质葡萄酒的先决条件之一。从成千上万的微生物中筛选 到最优良的葡萄酒用菌株是一个浩大的工程，耗时且耗力。一旦大量的酿酒酵母菌株从自 然生境中被分离出来，就需要依照相应标准进行筛选。符合筛选标准的菌株，需要经过小试 甚至中试酿造研究并经过感官鉴定专家评定后才有可能进行进一步研究。
[0017] 一般情况下，目前广泛应用的商业酿酒酵母菌株都是从自然生境中（如葡萄园、自 然发酵的葡萄汁)或葡萄酒酿造设备表面分离、筛选得到的天然菌株。葡萄表面分布着大量 的酵母菌落。因此，葡萄酒产地是新菌株最潜在的分离源。近年来，对适合于原产地葡萄酒 酿造的本土优良微生物的需求显著增加。这主要是因为本土微生物菌株的发酵能力更强， 在发酵过程中更易于取得优势地位并发挥出葡萄品种的风味及特色。将从特定产地的特定 葡萄品种上分离筛选到的酿造菌株应用于该地域该葡萄品种的发酵过程中，可以生产出更 具地域特色的葡萄酒。因此，研发一种工作量小、筛选周期短，节约人力、物力和时间的本土 葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种工作量小、筛选周期 短，节约人力、物力和时间的葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法。
[0019] 本发明的发明人在研究中发现，利用高通量筛选设备，结合选择性固体培养基（即 指示性培养基）对具有特定菌落形态或酿造特性的菌株进行初筛，然后利用微孔板对初筛 得到的菌株进行微型发酵复筛，将复筛得到的菌株进行微型发酵，发酵结束后对得到的发 酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架归集分组，再将不 同归集分组的菌株进行小试发酵，能够快速、准确而简便地筛选出适合特定产地、特定葡萄 品种或特定酿造需求的葡萄酒酿造用微生物。
[0020] 为了实现上述目的，本发明提供了一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法， 该方法包括如下步骤：
[0021] (1)将葡萄样品依次进行无菌取样、破碎和带皮自然发酵，取样并进行稀释，将稀 释的发酵液均匀涂布在特定培养基上进行培养获得所需筛选的微生物，利用高通量筛选设 备对培养基上的菌落进行筛选；
[0022] (2)将步骤（1)筛选得到的菌株点种在选择性固体培养基上进行培养，利用高通量 筛选设备对培养基上的菌落进行初筛；
[0023] (3)利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，对复筛得到的菌株进行微 型发酵，发酵结束后对得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株 进行代谢框架分组，通过分组将具有相同/相似代谢框架的菌株进行归集；
[0024] (4)将归集为不同分组的菌株进行小试发酵，利用理化检测和感官评定确定适合 作为葡萄酒酿造用微生物的菌株，并对该菌株进行鉴定。
[0025] 本发明方法能够快速、准确而简便地筛选出适合特定产地、特定葡萄品种或特定 酿造需求的葡萄酒酿造用微生物，与传统手工筛选方法相比，本发明方法能够大大降低工 作量，节约70%以上的人力，并将研发周期从1-3年降低至4-6个月。
[0026] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0027] 图1是利用主成分分析对酵母菌株进行归集分组的结果。
[0028] 图2是利用主成分分析对乳酸菌菌株进行归集分组的结果。
【具体实施方式】
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