一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体是涉及一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 天然水体中，氮以-3至+5九种不同价态形式存在，在生物及非生物因素的共同作 用下，它们在水体内不断地迀移转化，构成一个复杂的动态循环。其中氨氮、亚硝酸盐等可 以导致对湖泊、河流、近海海洋等的酸化和富营养化，同时作为具有潜在毒性的无机氮化合 物，也对养殖生物具有毒害作用。如何经济、高效地去除水体中的氮素污染，已成为水污染 控制领域的重点研宄内容。
[0003] 目前应用于水体脱氮的方法主要包括物理法、化学法及生物脱氮法。其中，物理、 化学法操作复杂，需要增加设备投资额，运行成本高。同时该方法对有机物去除效率低，会 造成二次污染，因此在实际运用中存在一定的局限性。近年来，人们开始尝试利用微生物、 植物或其他生物自身具有的功能消除或改变污染物存在形态，达到降低污染物毒性的目 的。与物理、化学脱氮相比，生物脱氮在系统内仅靠生物自身的能量循环和物质循环起作 用，不引入其他外来物质。由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、无二次污染、脱氮彻底等 优点，逐渐应用于工业废水脱氮处理。
[0004] 参与生物脱氮的微生物主要包括硝化细菌和反硝化细菌。传统理论认为，细菌的 反硝化作用是一个严格的厌氧过程，反硝化细菌会优先利用氧气作为最终电子受体。好 氧反硝化细菌的发现，突破了传统的认识，同时也为人们研宄新的生物脱氮技术提供了新 的思路。好氧反硝化，是指在有氧条件下能以NO 3 -N、NO2 -N作为最终电子受体，进行反硝 化过程。目前已发现的好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属（Pseudomonas)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、副球菌属（Paracoccus)和芽孢杆菌属（Bacillus)。尽管国内外对于好氧 反硝化菌的分离、筛选以及机理研宄较多，但优良菌种较少，仍无法满足目前工业生产的需 求。分离筛选高效好氧反硝化细菌，并对其好氧反硝化特性进行研宄，对含氮废水的生物脱 氮具有重要的理论价值和实际意义。
[0005] 中国专利CN 201410138167. 4公开一株具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株 HGMN521及其应用。具体涉及一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，该菌 株的保藏名称：盐单胞菌HGMN521，分类命名：Halomonas sp. HGMN521，保藏单位：中国典型 培养物保藏中心，保藏日期：2009年8月28日，保藏号：CCTCC NO !M209187,保藏地址：湖北 省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；还公开了该菌株HGMN521在处理受无机氮污染海 水中的应用。该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除受无机氮污染 海水中的亚硝酸盐氮（NCV-N)及硝酸盐氮（NCV-N)，且对海水养殖生物没有毒害致病作用， 具有安全、环保、高效的特点。
[0006] 中国专利CN 20120458579公开一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单 胞菌及其应用。该发明的盐田盐单胞菌BMEN3 (Halomonas campisalis BMEN3)，具有异养 硝化好氧反硝化功能，其保藏编号为：CGMCC NO. 6536。该发明筛选出的菌株Halomonas campisalis BMEN3在高盐高碱条件下仍具有异养硝化和好氧反硝化能力，而且菌株能在有 氧异养条件下生长，这大大提高了菌体的生长速率，提高挂膜速度，缩短反应器启动时间， 提高了脱硝效率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一株具有脱氮能力的盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1，该菌株在好氧条件下，能快速高效去除硝酸盐和亚硝酸盐，且对亚硝酸盐具有很 强的耐受性和去除能力。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供所述盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1在含氮废 水生物脱氮以及在水产养殖亚硝酸盐去除中的应用。
[0009] 所述盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1_6_1，已于2015年04月29日保藏于中国典 型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015266。
[0010] 所述盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1是从污水处理厂初沉池污泥中定向富集 分离获得。所述盐单胞菌（Halomonas sp.)CYQl-6-l也保藏于中国海洋微生物菌种保藏管 理中心（MCCC)，保藏编号为：MCCC 1A10904。
[0011] 所述盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1_6_1具有以下特征：
[0012] 1、形态特征：盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1_6_1，革兰氏阴性，在 Marine Agar 固体培养基上28°C培养24h，菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明，菌落直 径大小约为0. 5~1mm。
[0013] 2、生理生化特征：菌株生长盐度为0~6%，7%以上不生长，最适为1~3% ;生 长pH为6. 5~10. 5,最适为7. 5~9. 5。生长温度为10~45°C，最适为30~40°C。氧化 酶（+)，接触酶（_)，硝酸盐还原（+)，吲哚试验（_)，能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化（-)， 尿素酶（+)，β -葡萄糖苷酶（_)，β -半乳糖苷酶（_)，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙 酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸，不能利用癸酸、己二酸、、L-阿 拉伯糖、D-甘露糖。
[0014] API ZYM结果显示，盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQl-6-l具有碱性磷酸酶、酯酶、 类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、酸性磷酸酶、β-葡（萄）糖苷酶，不具有胱氨酸 氨肽酶、胰蛋白酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、α -胰凝乳蛋白酶、β -葡（萄）糖苷 酸酶、α -葡（萄）糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α -甘露糖苷酶、α -岩藻糖苷酶等酶活 性。
[0015] 3、16S rRNA基因序列分析：按照常规方法抽提盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1的基因组DNA，并对16S rRNA基因序列进行测定，盐单胞菌CYQ1-6-1的16S rRNA 基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] 经 BLAST 比对分析，盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQl-6-l 的 16S rRNA 基因 与 Halomonas daqingensis DQD2-30 (T) EF121854 相似性最高，分别为 98. 99 %，其次 为 H. kenyensis AIR-2(T)AY962237 和 H. desiderata FB2(T)X92417,分别为 98. 39 % 和 98. 38 % 〇
[0017] 综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析结果，本发明的 盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQl-6-l属于盐单胞菌属，为该属的一个潜在新种，具体为盐单 胞菌（Halomonas sp.)CYQl_6_l。
[0018] 本发明的盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1-6_1能快速高效去除水体中的硝酸盐和 亚硝酸盐，且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。
[0019] 所述脱氮作用在含氮模拟废水中进行，所述含氮模拟废水溶解氧浓度为0~ 7ppm〇
[0020] 所述含氮模拟废水的碳源为甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠及琥 珀酸钠，优选碳源为柠檬酸钠。
[0021] 所述含氮模拟废水的C/N为3~24,优选C/N为6~24。
[0022] 所述含氮模拟废水的pH值为5. 5~10. 5,优选pH值为7. 5~9. 5。
[0023] 所述含氮模拟废水的盐度为0~60g/L，优选为10~30g/L。
[0024] 所述含氮模拟废水的温度为15~45°C，优选为30~45°C。
[0025] 在优选条件下，盐单胞菌为（Halomonas sp. )CYQ1_6_1分别能在12h、16h和16h 内将模拟废水中的l〇〇mg/L Ν〇ΓΝ、NH4+-N和NO2--N完全去除，分别在36h、48h、60h和72h 将500mg/L、600mg/L、700mg/L和1000mg/L NO2--N完全脱除，具有高效脱氮能力。
[0026] 由此可见，盐单胞菌为（Halomonas sp. ) CYQ1-6-1在处理高浓度亚硝酸盐废水、含 氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除等中应用。
[0027] 所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水等。
[0028] 所述盐单胞菌为（Halomonas sp. )CYQ1-6_1能够耐受亚硝酸盐氮达4000mg/L〇
[0029] 本发明与现有技术相比有如下突出效果：
[0030] 1.本发明的盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQl-6-l以铵盐、硝酸盐或亚硝酸盐为唯 一氮源均能正常生长及脱氮，可适用于各种含氮废水的生物脱氮处理，是一株新发现的具 有高效脱氮性能的好氧反硝化菌株。该菌在有氧、无氧情况下均可进行无机氮素的去除，突 破了传统反硝化菌受氧气抑制的限制。
[0031] 2.本发明的盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQl-6-l能利用低浓度碳源（C/N = 3)进 行反硝化，脱氮效率高，在实际废水脱氮中可以节省碳源使用，该特性大大增加了盐单胞菌 为（Halomonassp.)CYQl-6_l 的实用性能。
[0032] 3.本发明的盐单胞菌（Halomonas sp.)CYQl-6-l对高浓度的亚硝酸盐耐受性强， 脱氮效率高，能在72h内将1000mg/L Ν02_-Ν完全去除。
【附图说明】
[0033] 图1为不同碳源对盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1-6_1去除硝酸盐的影响（右侧 纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0034] 图2为不同C/N对盐单胞菌（Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响（右侧 纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0035] 图3为不同pH对盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响（右侧 纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0036] 图4为不同盐度对盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1-6_1去除硝酸盐的影响（右侧 纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0037] 图5为不同温度对盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1-6_1去除硝酸盐的影响（右侧 纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0038] 图6为盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1_6_1在最适条件下对模拟废水中硝酸盐的 去除效果（右侧纵坐标对应NCV-N的含量及菌体浓度0D_两个值）。
[0039] 图7为盐单胞菌（Halomonas sp. ) CYQ1-6-1在最适条件下对模拟废水中亚硝酸盐 的去除效果。
[0040] 图8为盐单胞菌（Halomonas sp.) CYQ1-6-1对含高浓度亚硝酸盐的模拟废水的脱 氮效果（以 500、600、700、1000mg/l N(V-N)。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。下述的实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0042] 实施例1盐单胞菌（Halomonas sp. )CYQ1_6_1的富集、分离和鉴定
[0043] 1菌株的富集和分离：取厦门前埔污水处理厂初沉池污泥样品10g，加入90ml 富集培养基（乙酸钠 lg/L，柠檬酸钠 2. 5g/L，NaCl 20g/L，KH2P042g