一种抗破伤风类毒素的单克隆抗体和杂交瘤细胞株及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产生抗破伤风类毒素特异性抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体 和在吸附无细胞百白破联合疫苗和偶联疫苗研发和质量控制上的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 破伤风是一种由破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani)引起的高度致死性 疾病，主要发生于发展中国家，全世界每年死亡80至100万人，其中新生婴儿破伤风死亡50 万人。破伤风的预防主要通过主动免疫（破伤风疫苗）或被动免疫（破伤风特异性免疫球 蛋白）实现。破伤风疫苗由破伤风类毒素 （tetanus t〇X〇id，TT)制成，TT是一种经过脱毒 处理的类毒素，接种后可诱导机体产生保护性抗体。已上市的包含破伤风类毒素组分的疫 苗主要有单价破伤风疫苗，百日咳-白喉-破伤风联合疫苗多联疫苗。另外，破伤风类毒素 作为应用最广泛的载体蛋白被用于b型流感嗜血杆菌偶联疫苗、流脑多糖蛋白偶联疫苗、 肺炎多糖蛋白偶联疫苗中，预防婴幼儿多发的流行性脑膜炎、肺炎等疾病。以解决因婴幼儿 的免疫系统发育不完善，单纯的多糖抗原难以激发其产生足够的抗体免疫反应的不足。
[0004] 无论是破伤风疫苗、百白破联合疫苗还是以破伤风类毒素作为载体蛋白的多糖蛋 白偶联疫苗，在其研宄和生产过程中，均需要准确测定破伤风类毒素蛋白的含量，用于指导 工艺开发和疫苗质量控制。在现行的2010版药典中，此关键指标测定主要依赖于蛋白含 量测定方法（Lowry法）和絮状单位测定法。Lowry法是一种常用的蛋白浓度检测法，仅能 测定样品中总蛋白的含量，对于成分复杂的样品不能准确区分出破伤风类毒素蛋白和准确 反映蛋白的抗原性，且操作相对复杂，检测结果受实验操作的影响较大，对溶液配制等有较 高的要求，还会受到多种离子的干扰，难以做到高通量，检测灵敏度一般为微克（μ g)级。 而絮状单位测定法虽部分解决了待测样品抗原性测定的不足，但絮状单位测定法以Lf单 位浓度为标准。Lf单位是一个相对的效价单位，而非质量单位且属于半定量测定方法，人 为因素对结果的判定干扰较大，检测灵敏度也为微克（μ g)级。同时，此方法中待测样品中 可能存在的其它抗体也会干扰检测结果，这给疫苗研发过程质量控制带来了不确定性。因 此，开发一种高特异性、高敏感性、高通量的检测方法对疫苗的研制和质量标准控制具有重 要意义。
[0005] 单克隆抗体技术首先由德国科学家Kholer和英国科学家Melstein(1975)利用 杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技 术。该技术制备的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之 为单克隆抗体。本发明应用单克隆抗体制备技术，成功筛选出能分泌目标单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，该单抗不受检品中非目标蛋白的干扰，可特异性地与吸附无细胞百白破联合 疫苗、b性流感嗜血杆菌偶联疫苗、流脑偶联疫苗等疫苗中的破伤风类毒素结合，解决上述 疫苗中常规检测方法和应用中的不足。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种能产生识别破伤风类毒素特异性强、在检测破伤风类毒素 应用中灵敏度特别高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、及其单克隆抗体和应用。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 1. -种分泌特异性结合破伤风类毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株WV-TT-05， 其保藏号为 CCTCC NO :C2014200。
[0009] 2.抗破伤风类毒素的单克隆抗体是由技术方案1所述的杂交瘤细胞株WV-TT-05 分泌产生。
[0010] 3.技术方案2所述的抗破伤风类毒素的单克隆抗体在进行破伤风类毒素特异性 检测的应用。
[0011] 4.技术方案2所述的抗破伤风类毒素的单克隆抗体在吸附无细胞百白破联合疫 苗中检测破伤风类毒素含量的应用。
[0012] 5.技术方案2所述的抗破伤风类毒素的单克隆抗体在以破伤风类毒素为载体的 偶联疫苗中检测破伤风类毒素含量的应用。
[0013] 6.技术方案5所述的应用，所述的偶联疫苗为b型流感嗜血杆菌偶联疫苗或流脑 偶联疫苗。
[0014] 本发明所提供的一种分泌特异性结合破伤风类毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株WV-TT-05,已于2014年11月26日（保藏日）保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)， 保藏号为：CCTCC NO :C2014200。该保藏中心的地址是：中国，武汉，武汉大学，邮编： 430072,电话：（027) 68752319,传真：（027) 6875483,该杂交瘤细胞株WV-TT-05的存活性于 该保藏中心2014年12月3日检测为存活。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0016] 本发明分离筛选出了一种在含有破伤风类毒素等复杂成分的联合疫苗或偶联疫 苗中，能有效排除其它蛋白的干扰，与其它可能同时存在的非目标蛋白不发生交叉反应，能 有效避免样本中其它物质对实验结果的影响，特异性特别强地、精确定量检测出破伤风类 毒素含量、检测灵敏度高达到纳克（ng)级别的抗破伤风类毒素的单克隆抗体。
[0017] 本发明所提供的杂交瘤细胞株WV-TT-05通过细胞培养上清效价不低于1 :32000， 小鼠腹水制备的单克隆抗体效价不低于1 :100000,因此，本发明杂交瘤细胞株WV-TT-05能 够稳定地产生具有上述特性且性能优异、高质量的抗破伤风类毒素单克隆抗体。
[0018] 本发明所述一种抗破伤风类毒素的单克隆抗体在含有破伤风类毒素等复杂成分 的联合疫苗或偶联疫苗中的破伤风类毒素特异性检测的应用中，比现行中国药典2010版 中常规的蛋白含量测定方法（Lowry法）和半定量测定的絮状单位检测的微克（yg)级更 敏感，提高了检测的灵敏度，且操作简单，更适用于含有破伤风类毒素等复杂成分的疫苗开 发过程中的破伤风类毒素的质量检测和控制。
【附图说明】
[0019] 图1是破伤风类毒素封闭酶联免疫检测标准曲线。横坐标是TT标准品的6个稀 释度，取常用对数后绘制而成，记为lgTT。纵坐标为TT标准品的6个稀释度在450nm波长 时的吸光值记为A 45tl.
【具体实施方式】
[0020] 以下各实施例无特殊说明均为常规技术，各实施例中各种试剂、原料等均为市售 产品。以下各实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 :杂交瘤细胞株WV-TT-05的制备
[0022] 1.1抗原的来源
[0023] 破伤风类毒素抗原标准品（TT标准品）购自中国食品药品检定研宄院，其余三个 批号破伤风类毒素按照中华人民共和国药典2010版三部制备获得。
[0024] 1.2小白鼠来源
[0025] 雌性，6 周龄 BALB/c 鼠，SPF (无特定病原体 Specific pathogen Free, SPF)级， 12~15g，购自昆明医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK滇2011-0004)。
[0026] 1. 3骨髓瘤细胞的来源
[0027] 骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库 (KCB92021YJ)。
[0028] 1.4杂交瘤细胞株的制备
[0029] 采用体内免疫方式和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG)融合方法制备单克隆 细胞。
[0030] 1. 4. 1小鼠免疫及血清效价检测
[0031] 以50 μ 1 (含20 μ g)破伤风类毒素与50 μ 1福氏完全佐剂充分混合，两后肢胫前 肌注射BALB/c小鼠，2周后等量抗原与50 μ 1福氏不完全佐剂充分混合进行第二次免疫，最 后一次直接注射