ng，5，和 3’引物各 20 pmol，1Xbuffer 5 μ 1，dNTP 各 20 μ M，高保真 KOD plus(TOYOBO) Iulo按以下条件进行扩增:94°C预变性2分钟；94°C变性30秒、55°C退火30秒、68°C延伸1.5分钟，共30个循环。PCR产物经Sal I和Afoi I酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体PGEX-4T1 (GE life sciences)，测序验证其正确后得到大肠杆菌表达质粒PGEX-4T1-SDG708。
[0022]GST融合的SDG708重组蛋白在大肠杆菌中的表达纯化依据Glutath1neSepharose 4 Fast Flow (GE life sciences)的用户手册进行。
[0023]组蛋白甲基转移酶的体外活性测定按Rea等(Nature，2000，406:593 - 599)的方法进行:在 30 μ I MAB 测活缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.5),20 mM KCl, 10 mMMgC12，250 mM Sucrose, 100 μ M ZnC12，10 mM β-mercaptoethanol)中，加入的酶(GST —SDG708)，底物(核心组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4，购自 MiIIipore)和 250 nCi methyl-14C_SAM(GE life sciences)，混合均匀，37°C反应I小时。反应产物经15% SDS — PAGE分离并染色脱色，凝胶于70°C真空干燥2 hrs后放射自显影。
[0024]图1中上图为SDS — PAGE电泳考染结果，下图为放射自显影结果，酶活底物分别为组蛋白H3上带有正常36位赖氨酸(H3K36)的核小体和赖氨酸突变为丙氨酸(H3K36A)的重组核小体，已知的H3K9甲基转移酶GST-SDG714蛋白作为对照，结果显示GST — SDG708具有专一性的组蛋白H3K36甲基转移酶活性。
[0025]实施例3.检测对水稻生长发育的调控作用一、反义表达载体的构建
利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，以基因为靶基因，构建RNA干扰载体。以实施例1得到的PUC19- SDG708为模板，分别以两对不同的引物PCR扩增SDG708U 5’端第363到612位的核苷酸序列，作为发夹结构的互补DNA双链。所用的引物对 I 为:5，_ ccatggctgcagAtggaaggaagccaagagga-3，( SEQ ID No:7)和5，— gaattcAaagttgtagtcataggata — 3，( SEQ ID No:8)，所得 PCR 产物为 fSDG708i(forward)。引物对 2 为 5，- tctagaAtggaaggaagccaagagga-3，( SEQ ID No:9)和5，一 aagcttAaagttgtagtcataggata — 3，( SEQ ID No: 10),所得 PCR 产物为 rSDG708i(reversed)。为了便于后续的载体构建，在fSDG708i的5’和3’端分别添加了 AfcoI和EcoR I的限制性酶切位点，在rSDG708i的5’和3’端分别引入了 I和HindVll的限制性酶切位点。
[0026]为了便于RNAi载体的构建，在连接正反两条DNA分子的内含子(由法国植物分子生物学研宄所赠送)两端通过PCR方法分别引入了 II和I的限制性酶切位点，所用引物为:5，— aaaagcttccaatttggtaaggaaataatt 一 3，( SEQ ID No: 11)和 5，一aagaattctttcgaacccagcttccc—V ( SEQ ID No:12)。
[0027]将fSDG708i经Nco I和&oR I双酶切，内含子经HindYW和&oR I双酶切，rSDG708i经Xba I和Hindi 11，连接入经Nco I和ZhI双酶切的pHB载体(由中科院上海植物生理研宄所林鸿宣课题组赠送)中，即得RNA干扰载体P挪一 fSDG708i~ PDK intron —rSDG708i (以下简写为 pHB_708Ri)。
[0028]二、反义表达载体转化水稻植株
参照Hiei等(Plant Mol B1l，1997，35:205 — 218)的方法转化水稻。将质粒/7挪通过电激法转入根瘤农杆菌EHA105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒/7挪的农杆菌H1105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中28°C摇菌培养至对数生长期晚期，再1:100扩大培养到0D_为0.5左右。将菌体重悬于转染培养基中。按常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至1cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。为了进一步确定该转基因性状的稳定遗传，将后来得到得T2代种子在室外网室种植，结果如图2所示，转RNA干扰载体的水稻708R1-m目比野生型水稻(WT )均表现出明显的晚花表型。
[0029]三、荧光定量PCR检测转反义5ZW7仍基因水稻中5ZW7仍韵表达
在相同条件下对转反义5ZW7仍基因水稻和野生型水稻进行培育。按实施例1中相同方法提取水稻总RNA并且反转录合成cDNA。然后用荧光定量PCR检测转反义SDG708m因水稻和野生型水稻中SDG70_表达情况。检测SDG70m\用引物为:5 ’ 一AAGCCAATATGCTGCGACAA — 3’ (SEQ ID No: 13)，5’一 CCAAAAGGCCCCATCCA — 3’ (SEQ IDNo: 14)。结果如图3所示，相对于野生型水稻，表达在转反义因水稻708Ri~m中呈现明显的下降，进一步证明转反义5ZW7仍基因水稻的表型缺陷是由于表达下降而引起的。
【主权项】
1.一种水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶，其特征在于来源于水稻，名称为SDG708，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:(1)SEQ ID No:1; (2)将SEQID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。2.编码权利要求1所述的组蛋白赖氨酸甲基转移酶的基因。3.根据根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是下述核苷酸序列之一: (1)SEQID No:2的核苷酸序列； (2)编码SEQID No:1蛋白质序列的DNA ; (3)与SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的表达载体。5.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的转基因细胞系。6.扩增权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因中任一片段的引物对。7.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于为SEQID No:3和SEQ ID No:4。8.权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因在植物生长发育中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:将所述水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的反义表达载体转化水稻，得到具有晚花表型的水稻。
【专利摘要】本发明属于生物基因工程技术领域，具体为一种水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶及其编码基因与应用。本发明的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶是下述氨基酸残基序列之一：序列表中的SEQ ID No：1；将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。该水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶的编码基因的反义转基因株系呈现出晚花表型。本发明为植物品种改良提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
【IPC分类】A01H5/00, C12N9/10, C12N15/82, C12N15/54, C12N5/10, C12N15/11
【公开号】CN104911157
【申请号】CN201510360749
【发明人】董爱武, 俞瑜, 刘兵, 石金磊, 金菁
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月26日