Dna分子克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种DNA分子克隆的方法。
【背景技术】
[0002]DNA分子克隆技术是分子生物学中的常规和基础技术，在分子生物学研宄中具有重要作用。传统的酶切连接法是最早并且至今仍然广泛使用的DNA克隆技术，它利用限制性酶切消化和DNA连接酶进行连接。但这种传统方法也存在着一些明显的局限，例如关键的酶切位点可能出现在需要组装的序列中，以及较难利用这种技术进行2个以上DNA片段的克隆。Daniel Gibson于2009年发明了一种新的克隆方法一Gibson拼接法，用于DNA片段的直接拼接和克隆。Gibson拼接法是一种简单的等温一步拼接法，且不依赖于DNA片段上的序列，只需将DNA片段或DNA片段与线性化载体混合，加入T5核酸外切酶、Phus1n聚合酶和Taq连接酶，在50°C反应I小时即可完成拼接。
[0003]但是Gibson拼接法只能将DNA克隆到线性化的载体，因此反应前需将质粒载体通过PCR扩增或酶切的方法进行线性化。现有技术未能提供一种快速有效的将DNA直接克隆到环形质粒载体上。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明第一方面提供一种DNA分子克隆方法，其包括如下步骤:获得含有ccdB基因的目标载体，所述ccdB基因两端分别具有SfiI酶切位点和第一接头序列及第二接头序列，所述第一接头序列和第二接头序列为15_30bp，所述第一接头序列和第二接头序列分别在SfiI酶切位点两侧；获得目标基因，所述目标基因两端分别带有第三接头序列及第四接头序列，其中所述第一接头序列与第三接头序列序列一样，所述第二接头序列和第四接头序列一样；优选的，第一接头序列为ACCTAGGTTCTGGGCCAGGA，第二接头序列为CCTGAGACCGAAGGCCCAGA。将所述含有ccdB基因的目标载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液混合反应。在本发明一个优选的实施例中，所述ccdB基因带有的SfiI酶切位点和第一接头序列通过PCR扩增引入。
[0005]在本发明一个优选的实施例中，所述PCR扩增所用的引物为:上游引物FP(SEQID NO:1):GAGACCTAGGTTCTGGGCCAGGATGGCCATTCTCGACTAAGTTGGCAG,下游引物 RP (SEQ IDNO:2):AACCACCTGAGACCGAAGGCCCAGATGGCCCTGTGTATAAGGGAGCCTG，
[0006]在本发明一个优选的实施例中，所述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收后克隆到重组载体中。
[0007]在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因带有的第二接头序列通过PCR扩增引入。
[0008]在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因为拟南芥VIPl基因，更优选的，所述 PCR 扩增的上游引物 FP-1 (SEQ ID NO:4):ACCTAGGTTCTGGGCCAGGAATGGAAGGAGGAGGAAGAGG，以及下游引物 RP-1 (SEQ ID NO: 5):CCTGAGACCGAAGGCCCAGAGCCTCTCTTGGTGAAATCCA。
[0009]在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因为拟南芥ABCGll基因，更优选的，所述 PCR 扩增的上游引物 FP-2 (SEQ ID NO: 6):ACCTAGGTTCTGGGCCAGGAATGGAGATAGAAGCAAGCAGAC，以及下游引物RP-2(SEQ ID NO:7):CCTGAGACCGAAGGCCCAGACCATCTGCGAGCTCCATCTG。
[0010]在本发明一个优选的实施例中，将所述含有ccdB基因的目标载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液进行混合反应，反应条件为50°C反应60分钟。
[0011]在本发明一个优选的实施例中，在将所述含有ccdB基因的重组载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液混合反应的步骤后，取5 μ L反应混合物转化大肠杆菌Ε.coli感受态细胞，随机挑选6个菌落进行鉴定。
[0012]本发明另一方面提供一种目的基因的重组载体，所述载体由上述DNA分子克隆的方法而制备。
[0013]本发明的提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点:
[0014]第一，现有技术中的Gibson克隆只能将基因克隆到线性化载体上，因此克隆前需要先通过酶切或PCR扩增将质粒载体线性化。而本方法利用ccdB基因和SfiI酶，能通过Gibson反应将基因直接克隆到环状质粒载体，省去了载体的线性化这一步操作，节约了时间和成本。
[0015]第二，本方法利用ccdB基因能消除背景质粒载体的干扰，实现重组载体的零背景；利用SfiI酶能不受目标基因的序列限制(SfiI酶识别位点为稀有酶切位点)，且工作温度与Gibson反应一致，SfiI酶切反应(将载体线性化)的同时进行Gibson反应，克隆效率高。本方法将克隆步骤简化到了极点。
【附图说明】
[0016]图1是本发明实施例中DNA分子克隆方法的步骤示意图，其中目标克隆载体(环状质粒)的克隆位点处含有Sfi I酶切位点、CCdB基因的结构。目标DNA片段外围有15-30bp的接头序列，分别与目标载体两个SfiI酶切位点外围接头序列相同。目标DNA片段，SfiI酶和Gibson克隆反应液与环状目标载体混合，反应后进行转化获得含目标DNA的重组质粒。
[0017]图2是ccdB基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DL2000Marker (大连宝生物)；1:ccdB基因PCR扩增产物。
[0018]图3拟南芥VIPl基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DL2000Marker (大连宝生物)；1:VIP1基因PCR扩增产物。
[0019]图4拟南芥ABCGll基因PCR的琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DL2000Marker (大连宝生物)；1:ABCG11基因PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0020]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0021]本发明的内容是先构建一个与之配套的目标载体，其克隆位点处含有SfiI酶切位点、ccdB基因(致死基因)、Sfi I酶切位点的结构；根据目标DNA和载体插入处两个SfiI酶切位点外围的序列设计合成PCR扩增引物，再PCR扩增，获得目标DNA ;直接将目标载体和目标DNA混合，加入SfiI酶和Gibson克隆反应液(NEB公司)，50度反应I小时后即可转化大肠杆菌感受态细胞，培养并挑取菌落后经鉴定获得正确的重组克隆(实施例未详述的方案和配方，请参见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)。
[0022]实施例1:含有ccdB基因和接头序列的重组目标质粒载体pccdB的构建
[0023](I)含接头序列的ccdB基因的克隆
[0024]根据ccdB基因的核酸序列(GenBank数据库登录号:JQ085427)和引物设计的一般规则，设计两条引物，上游引物 FP(SEQ ID NO:1):GAGACCTAGGTTCTGGGCCAGGATGGCCATTCTCGACTAAGTTGGCAG(其中有下划线的序列为接头序列，阴影序列为SfiI酶切位点，没有下划线的序列为ccdB基因特异序列)，以及下游引物RP(SEQ ID NO:2):AACCACCTGAGACCGAAGGCCCAGATGGCCCTGTGTATAAGGGAGCCTG (其中有下划线的序列为接头序列，阴影序列为SfiI酶切位点，没有下划线的序列为ccdB基因特异序列)。
[0025]以含ccdB基因的质粒pRNA1-GG (GenBank数据库登录号:JQ085427)为模板，利用上述两条引物进行PCR扩增，PCR扩增程序为:94°C 4分钟；再94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 60秒，30个循环；最后72°C延伸5分钟。PCR扩增得到ccdB基因的PCR产物。
[0026]将上述ccdB基因的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。电泳结果显示扩增得到一条位于500bp和750bp之间的条带，与预期大小的666bp符合。因此将此条带进行回收，回收利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)，按照说明书进行。
[0027](2) ccdB基因克隆到pMD-T载体
[0028]将上述ccdB基因的PCR回收产物与pMD-T载体(大连宝生物公司，产品编号6011)混合，进行TA克隆。获得的克隆送Invitrogen公司(广州)测序，结果显示重组载体中含有正确的ccdB基因序列以及随引物引入的SfiI酶切位点和接头序列。
[0029]将上述克隆有ccdB基因以及SfiI酶切位点和克隆接头序列的重组pMD-T载体命名为pccdB，其结构示意图见图1。pccdB的序列见SEQ ID N0:3。
[0030]SEQ ID NO:3
[0031]cggagaccatggagggccttcaaggccattctcgactaagttggcagcatcacccgacgcactttgcgccgaataaatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaacttttgctgacgagaacagggactggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcctgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtatccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgacaggctcccttatacacagggcctagtgggccggtctcttcaggaggtaaatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt