的方法 称取50 mg辅酶NADP加入到10 ml含有50 mg/ml酮还原酶的磷酸盐缓冲液（pH 7.0) 中，4°C静置I h;在上述溶液中加入1.5 g实施例1中制备的SBA-15/Fe304-NH2,25°C， 100-150 rpm，温浴8 h，得悬浮液，磁性吸附去上清，沉淀用生理盐水洗涤，重复三次，得到 的固体即为羰基还原酶与辅酶的共固定化酶，冷冻干燥后于4°C保存备用。
[0024] 实施例4本实施例说明反应合成（3S)_3_(叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯 基-(2R)-丁醇的方法 称取5 g底物（3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮加入到37 ml三 乙醇胺缓冲液中（pH 8. 5)，再依次加入10 ml甲苯、3 ml异丙醇、I. 5 g实施例2中所述的 共固定化酶，35°C搅拌，开始反应。48 h后磁性吸附，将磁性吸附获得的固定化酶用生理 盐水洗涤，5000 rpm离心10 min，此洗涤过程重复3次，将固定化酶冷冻干燥，4°C保存备 用。将上清液用乙酸乙酯萃取，旋蒸，得到产物（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯 基-(2R)-丁醇。
[0025] 其中，附图2、3分别为反应24h和48h的HPLC图谱 有图可知，在反应24h后分别检测到产物与底物，但在48h底物已转化完毕，只有产物 和甲苯。
[0026] 反应结果显示，转化率达到99%的时间为48h。
[0027] 实施例5本实施例说明另一反应合成（3S) _3_ (叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯 基-(2R)-丁醇的方法 称取5 g底物（3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮加入到37 ml三 乙醇胺缓冲液中（pH 8. 5)，再依次加入10 ml甲苯、3 ml异丙醇、I. 5 g实施例3中所述的 共固定化酶，35°C搅拌，开始反应。48 h后磁性吸附，将磁性吸附获得的固定化酶用生理盐 水洗涤，此洗涤过程重复3次，将固定化酶冷冻干燥，4°C保存备用。将上清液用乙酸乙酯萃 取，旋蒸，得到广物（3S) _3_(叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基-(2R)-丁醇。
[0028] 其中，附图4、5分别为反应24h和48h的HPLC图谱 由图可知，在反应24h后分别检测到产物与底物，48h底物也基本反应转化。
[0029] 反应结果显示，转化率达到99%的时间为60h。
[0030] 实施例6本实施例说明液相检测的方法标品的图谱 液相检测的方法与条件为：采用高效液相色谱（DIONEX Ultimate 3000)进行检测，色 谱柱为 venusil MP C18 (250 mm X 4. 6mm，5 μ m)，流动相为 10 mM KH2PO4 (pH 4· 0)-乙腈 (梯度洗脱，比例见下表），流速1.0mL/min，柱温35 ° C，UV检测波长210nm，进样量为5 μ L0
标品的结果见附图6。附图6为（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2-丁 酮、（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇及甲苯的标准品的HPLC谱图； 其中，第一个峰为（3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁醇；第二个峰为甲苯， 第三个峰为（3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮 实施例7，本实施例说明反应合成（3S) _3_ (叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯 基-(2R)-丁醇的优选实施例 本实施例采用实施例1和实施例2所述的方法获得修饰后的磁性介孔材料并进行固 定化，在获得磁性修饰材料后，按照实施例2所述的方法进行固定化，与实施例2的不同之 处在于，所用辅酶NAD的量为50mg，氧化还原酶的量为250 mg，然后采用实施例4所述的 方法进行反应，与实施例4的不同之处在于，所用物料的量为底物5g，甲苯2. 5ml、异丙醇 I. 91ml、固定化酶0. 93g、45ml缓冲液。
[0031] 最终，反应转化率超过99%的时间为59 h。
[0032] 实施例8本实施例说明反应合成（3S)-3-(叔丁氧幾基）氨基-1-氯-4-苯 基-(2R)-丁醇的优选实施例 本实施例所采用的方法与实施例7类似，与实施例7的不同之处在于，所用辅酶NAD的 量为50mg，氧化还原酶的量为Ig ;然后采用实施例4所述的方法进行反应，与实施例4的不 同之处在于，所用物料的量为底物5g,甲苯7. 5ml、异丙醇3. 18 ml、固定化酶1.88g、39ml 缓冲液。
[0033] 最终，反应转化率超过99%的时间为43 h。
[0034] 上述实施例只为说明本发明的技术构思与特点，本发明保护范围并不限定于此。
【主权项】
1. 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，以（3S)-3-(叔丁氧幾基）氨基-1-氯-4-苯 基-2- 丁酮为底物，以羰基还原酶与辅酶为催化剂，在缓冲液、助溶剂和共底物存在的体系 中催化合成（3S) _3_ (叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基_2_ 丁醇，其特征在于，所述幾基 还原酶和辅酶共固定化于经过修饰后的磁性介孔材料上。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共底物为异丙醇，助溶剂为甲苯。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述介孔材料为SBA-15、MCM-41、MCM-48 中的一种，优选SBA-15。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶为NAD/NADH或NADP/NADPH。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得所述修饰后的磁性介孔材料的步骤 为： (1) 将介孔材料加入到含有（NH4)2Fe(SO4) 2. 6H20、NH4Fe(SO4) 2. 12H20的水溶液中，用氨 水调节pH至11~12,40-70 °C搅拌，获得含有磁性的介孔材料； (2) 将步骤（1)中获得的磁性介孔材料加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入 冰醋酸至pH维持在3. 0-5. 0,向体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)，50-80°C搅拌 24-36h，分离获得固体，即得修饰后的磁性介孔材料。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，底物初始浓度为50-200mg/ml，助溶剂用 量为总反应体积的5-20%，共固定化酶、异丙醇、底物的投料质量比为0. 05-0. 1:0. 3-0. 5:1。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，辅酶与羰基还原酶的质量比为1:5-20。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的反应条件为：pH8. 0-8. 5,搅 拌速度100-150转/分钟，温度30-40°C，反应转化率达到99%，结束反应。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述任一权利要求所述的介孔材料平均 孔径为2-50nm，比表面积为500-1500m2/g。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的合成步骤为： (1) 将介孔材料加入到含有（NH4)2Fe(SO4) 2. 6H20、NH4Fe(SO4) 2. 12H20的水溶液中，用氨 水调节pH至11~12,40-70 °C搅拌，获得含有磁性的介孔材料； (2) 将步骤（1)中获得的磁性介孔材料加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入 冰醋酸至pH维持在3. 0-5. 0,向体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)，50-80°C搅拌 24-36h，磁性吸附，即得修饰后的磁性介孔材料； (3) 将辅酶加入到含羰基还原酶的pH为6. 0-7. 0的磷酸盐缓冲液中，4°C静置0. 2-2 h； (4) 在步骤（3)的溶液中加步骤（2)中制备的修饰后的磁性介孔材料，100-150rpm， 25°C温浴2-8h，得悬浮液，磁性吸附，去上清，磁性固体用生理盐水洗涤，重复2-4次，得固 体即为羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系，冷冻干燥后，4°C保存； (5) 将底物（3S)_3_(叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基_2_丁酮、助溶剂、异丙醇、共固 定化酶及pH8. 0-8. 5为三乙醇胺的缓冲液加入到反应器中，100-150rpm搅拌，30-40°C 保温反应，转化率>99%，反应结束； (6) 通过磁性吸附从步骤（5)的反应液中回收步骤（4)所述的共固定化酶体系； (7) 分离纯化所述步骤（5)的反应液，获得产物（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯- 4-苯基-(2R)-丁醇。
【专利摘要】本发明公开了一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，包括制备磁性修饰的介孔材料，将羰基还原酶与辅酶共固定化于磁性介孔材料，并用该固定化酶催化 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁酮生成 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇中间体。本发明具有羰基还原酶与辅酶的回收利用率高、辅酶再生效率高、成本低、市场前景广阔等优点。
【IPC分类】C12P13/02, C12N11/14
【公开号】CN104911224
【申请号】CN201510363243
【发明人】黄和, 唐苏苏, 江凌, 徐晴, 徐娴
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月26日