用于检测艾滋病治疗药物3tc和ftc耐药突变位点的引物对和探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐 药突变位点的引物对和探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 艾滋病是一种由HIV感染引起的免疫缺陷综合症。HIV属于逆转录病毒科，慢病毒 属。目前发现的HIV病毒有HIV-I和HIV-2两型，但世界上流行的艾滋病大多数是由HIV-I 引起的。HIV-I基因组约为9. 7kb，由两条单链RNA链组形成二聚体。基因组包含gag、pol 和env三个结构基因和tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6个调苄基因，在5'末端和3'末端 为长重复序列（LTR)。Gag最初表达成55Kd的蛋白前体，然后由病毒蛋白酶切割成17Kd (P17)的基质蛋白（MA)、24Kd (p24)的衣壳蛋白（CA)、7Kd (p7)的核衣壳蛋白（NC)及pi、 p2和p6蛋白用于构成病毒的核心结构。Pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶三个病毒 主要蛋白酶用于蛋白前体的成熟、病毒基因组RNA的逆转录和病毒cDNA在宿主基因组DNA 上的整合。Env基因编码糖基化的160Kd (gpl60)的膜蛋白，然后切割成表面糖蛋白gpl20 和跨膜糖蛋白gp41用于宿主细胞的识别和病毒与宿主细胞的膜融合，同时HIV-I基因组还 编码tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6个非结构基因用于调控HIV-I病毒的感染、增殖与释放 等过程。
[0003] 在HIV-I广泛传播，迅速蔓延而又没有有效疫苗预防的情况下，化疗药物成为抗 HIV-I感染最有力的工具。1985年，科学家们发现了第一种HIV-I治疗药物齐多夫定（AZT)， 并在1987年通过了美国食品药品管理局（FDA)的批准应用于临床治疗，到目前为止已经有 30余种抗HIV-I药物用于艾滋病的临床治疗。虽然抗HIV-I治疗药物的使用尤其是HAART 疗法的推广大大地降低了 HIV-I感染的死亡率，提高了 AIDS患者的生活质量，但是HIV-I 耐药突变的产生和蔓延也给HIV-I的药物治疗带了很大挑战，在很大程度上降低了 HIV-I 的治疗效果。由于HIV-I的逆转录酶在复制过程中没有校正功能，而且HV-I复制迅速，从 而使得HIV-I易于进化、遗传多样性广泛，为HIV-I的耐药突变迅速产生提供了先决条件。 目前，对应于每种临床使用的HIV-I治疗药物都有其相应的耐药突变的产生。
[0004] 拉米夫定（3TC)和恩曲他滨（FTC)是目前常用的两种HIV核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs )，但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。过去的研究已经证 明引起3TC和FTC耐药产生的主要耐药突变是pol结构基因的M184V、M184I、Q151M和K65R 四种突变。
[0005] 目前应用于检测HIV-I耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。该方法存在 以下缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高，由于DNA 直接测序存在的灵敏度较低(灵敏度只能达到10%)，杂合突变、胶压缩、GC富集区等问题， 使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等问题，因 此直接测序方法很难适用于临床检测。因此，到目前为止HIV-I耐药突变情况检测还一直 停留在科研水平，主要用于流行病调查研究，还没有用于临床艾滋病患者指导用药的耐药 突变检测的报道。
[0006] 随着艾滋病治疗过程中耐药情况的日益加重，临床上迫切需要开发一种快速、准 确、操作简便和避免交叉污染的HIV-I耐药突变检测方法，用以满足临床用药和检测诊断 方面的时效性及个体化医疗方面的要求。
【发明内容】
[0007] 发明目的：为解决现有技术检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的方法 存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种 灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的 引物对和探针，还提供了一种包括上述引物对和探针的检测试剂盒。
[0008] 技术方案：本发明提供的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的 引物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点 M184V、M184I、Q151M 和 K65R 的 ARMS 引物对和 Taqman 探针； M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示的 核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5'端 和3'立而； 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和 探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位突变位点M184V、M184I的ARMS引物 对和Taqman探针； M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对 和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物和 Taqman 探针； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和 探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物和Taqman 探针； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示的 核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5'端 和3'立而； 本发明还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂盒，其 特征在于：包括上述的ARMS引物对和探针。
[0009] 作为优选，所述试剂盒还包括RT-PCR缓冲液（20mM Tris-Hcl，50mM KCL PH8. 3)、dNTPs、MgCl2、M_MLV 逆转录酶、Taq DNA 聚合酶。
[0010] 作为更进一步优选，所述试剂盒还包括模板RNA、试剂盒质控品引物对和试剂盒质 控品的Taqman探针，试剂盒质控品引物对的上游序列和下游序列分别为SEQ ID No. 11和 SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；试剂盒质控品的Taqman探针为SEQ ID No. 13所示的核 苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5'端和3'端。
[0011] 作为更进一步优选，各组分含量分别为： RT-PCR缓冲液终浓度0. 5X~2X ; dNTPs 终浓度 0· 6 ~I. 2mM ; ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为 100 ~600nM ; M-MLV逆转录酶终浓度0. 4~2. 4U/ μ L ; TaqDNA聚合酶终浓度0· 01~0· 06U/ μ L ; MgCl2终浓度为L 5~3. 5mM ; ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为100~ 600nM ； 模板RNA终浓度0· 01~IOOng/ μ L。
[0012] 最优选地，各组分含量分别为： RT-PCR缓冲液终浓度I X ; dNTPs 终浓度 0. 8mM ; ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为 200nM ； M-MLV逆转录酶终浓度I. 6U/ μ L ; TaqDNA聚合酶终浓度(λ 04U/ μ L ; MgCl2终浓度为2mM ; ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为IOOnM ; 模板RNA终浓度0· 1~IOng/ μ L。
[0013] 本发明还提供了上述ARMS引物对、Taqman探针的设计方法如下： (1)根据目的基因的突变位点设计ARMS引物对； (2)根据步骤（1)所述引物的扩增产物序列设计ARMS弓丨物对的Taqman探针。
[0014] 步骤（1)中，ARMS引物对的上游引物或下游引物的3'末端为突变位点，并将位于 突变位点上游第1-2位进行错义突变。
[0015] 步骤（2)中，ARMS引物对的Taqman探针为特异识别ARMS引物扩增产物正义链的 Taqman 探针。
[0016] 本发明还提供了上述ARMS引物对和探针在检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药 突变位点中的应用，基于RT-Real-time PCR技术鉴定耐药性突变位点，具体为： (1) 根据HIV-I病毒RNA的pol基因序列比对结果，选择保守区域，利用Primer premier 5. 0软件设计试剂盒质控品引物对和探针，提取模板RNA ; (2) 利用ARMS引物对和ARMS引物对的Taqman探针对提取的模板RNA进行RT-Taqman qPCR检测，并以试剂盒质控品引物对和探针的扩增结果作为阳性对照。
[0017] 优选地，检测试剂盒检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的反应条件 为：
[0018] 该技术基于RT-Real-time PCR平台，结合ARMS突变富集技术。利用ARMS引 物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对