KTA Purifier 100(GE Healthcare)仪器进 行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图每组样品合并成10份， 冻干后 C18Cartridge (Sigma)脱盐。
[0048] 3.质谱鉴定及数据分析
[0049] 每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A液为 0. 1 %甲酸水溶液，B液为0. 1 %甲酸乙腈水溶液（乙腈为84 % )。色谱柱以95 %的A液 平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100ym 5ym_C18)，再经分析柱 Thermo scientific EASY column(75ym*100mm 3ym_C18)分 离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0%到35% ; 100111丨11-108111丨11，8液线性梯度从35%到100%;108111丨11-120111丨11，8液维持在100%。每份 样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪（Thermo Finnigan)进行质谱分 析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨 率：70,OOOat m/z200,AGC target:3e6,一级Maximum IT:10ms，Number of scan ranges:1， Dynamic exclusion:40. 0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全 扫描（full scan)后米集 10 个碎片图谱（MS2scan)，MS2Activation Type:HCD，Isolation window:2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，Microscans:l，二级 Maximum IT:60ms， Normalized collision energy:30eV，Underfill ratio:0.1%。原始数据经降噪、去同位 素等步骤获得峰图列表。同时建立参考蛋白序列数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定，鉴定的 方法即使用专门的蛋白质鉴定软件Mascot2. 2对参考数据库进行搜索。本试验所使用的 数据库为 uniprot_oryza.fasta。结果过滤参数为：Peptide FDR <0.01。采用 Proteome Discovererl. 3软件对肽段报告离子峰强度值进行定量分析。差异蛋白进行GO功能注释分 析及验证
[0050] 应用Mascot软件对样品间差异表达蛋白进行表达量计算，当同一蛋白在样品间 的丰度比接近1时，表明该蛋白的表达量在样品间差异不显著，而当蛋白质丰度比达到1. 2 以上，且经统计检验P-value小于0. 05时，认为此蛋白为两样品间的差异蛋白。在无菌水处 理及稻瘟病菌侵染24h后，各组差异表达蛋白数量相当（309~322个），上调表达为137~ 153个，下调为161~177个。
[0051] 为了进一步挖掘稻瘟病菌诱导的差异蛋白的表达情况，利用Venny在线作图工具 对各处理之间差异蛋白进行交集比对后发现，在稻瘟病侵染24h后，ZE品种特异性表达的 蛋白有62个（28个上调，34个下调），ZE和H4共同差异表达的蛋白有31个（15个上调， 16个下调），而H4品种则有88个差异表达蛋白（上调50个，下调38个）。进一步的对这 些差异蛋白进行的GO注释分析发现：这些差异表达蛋白显著富集在生理过程、响应刺激、 生物胁迫或非生物胁迫等、代谢等。
[0052] 三、miRNA鉴定及其靶基因分析。
[0053] I. Small RNA的分离、回收及测序
[0054] 将RNA样品加入等体积的8M尿素上样缓冲液，于80°C水浴中变性5min，迅速放到 冰上2min以上，用微量进样器上样；500V电泳I. 5h后，在紫外灯下，将对应于18-30nt的小 分子RNA切下来，转移到L 5mL的离心管；加入ImL (λ 3M乙酸钠（ρΗ5· 2)和40U Rnasin， 16-25°C振荡 2h ;4°C，12000rpm 离心 lOmin。收集上清，并向胶中加入 0· 3M NaAc(pH5. 2)， 16-25°C振荡 2h ;4°C，12000rpm 离心 lOmin。收集上清，并向胶中加入 0· 3M NaAc(pH5. 2)， 16-25°C振荡过夜；4°C，12000rpm离心10min。收集上清，转移到I. 5ml离心管中，每管 0. 33ml ;加入2 μ 1肝糖原和3倍体积的无水乙醇，-80°C沉淀20min或-20°C沉淀过夜； 4°C，HOOOrpm 离心 30min。去上清，DEPC 水溶解 RNA，稀释 RNA 至 300 μ 1 ;加入 33 μ I 3M 乙酸钠（ρΗ5. 2)，900 μ 1无水乙醇，2 μ 1肝糖原混匀，于-80°C沉淀20min或-20°C沉淀过 夜；4°C，HOOOrpm离心30min，去上清，70%乙醇洗涤RNA沉淀，空气干燥，加入40 μ L DEPC 水和1 μ I RNasin溶解RNA，-80°C保存备用。按图2流程，构建small RNA测序文库。将 回收的18_30nt small RNA与5' adaptor、3' adaptor连接，并进行反转录；反转录产物于 Solexa High-throughput Sequencer(Illumina, USA)进行测序，由华大基因（深圳）完成。
[0055] 2.测序结果的生物信息学分析。
[0056] 将Solexa测序所得的35nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度及 分布等过程完成初级分析。将初级分析所得到的序列作分类注释，获得样品中包含的各组 分及表达量信息。测序获得4个small RNA文库的数据，其统计结果见表2。A文库（ZE-CK)、 B 文库（H4-CK)、C 文库（ZE ⑶0193)、D 文库（H4-GD0193)分别获得 10521573、14885325、 12439284U3644512的高质量测序片段；去除无3'端序列、无插入序列、5'端接头污染等， 8749036、12157795、9937360、11138187clean reads 可分别于 A、B、C、D 4 个文库中获得。 Clean reads 分布于 10_30nt 间，主要以 21nt、24nt 为主。
[0057] 表2 Small RNA测序数据产出统计
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[0060] 文库间的small RNA组成在不同的水稻品系间、不同处理间均表现一定程度变异。 抗、感材料的small RNA组成在对照处理或者病原菌诱导下均表现较大差异，表明抗、感材 料间在正常生长状况下表型差异等同样也可引起small RNA表达变异，79216 (3. 15% )和 97743(10. 73% ) small RNA序列分别为对照处理的文库间（A、B)和病原菌处理的文库间 (C、D)所共有；然而，文库间表现最显著的差异是由病原菌诱导中二软占文库（A、C)产生 的，A、C文库间仅共有64782 (2. 72% ) small RNA序列，且A文库具有所有文库内最丰富的 small RNA序列；相反地，H4文库间（B、D)的变异是最小的，即病原菌诱导的抗病品系small RNA组成的变异最小，它们具有123609(11. 94%)的相同序列。因此，不同的small RNA的 表达谱应与水稻品系间的稻瘟病抗性差异相关。为了获取与病原菌诱导相关的已知miRNA， 本研宄将稻瘟病菌⑶0193处理后的文库与对照文库进行比对，并分别使用log 2-ratio比 较这些miRNA在不同文库中的相对表达量差异情况。ZE_GD0193与ZE_CK比较后，ZE和H4 中分别有21个和28个miRNA在稻瘟病菌侵染后表达量显著升高，分别有102个和13个 miRNA在稻瘟病菌侵染后表达量显著降低。
[0061] 将4个文库中共296个miRNA提交到psRNATarget网站中，以MSU7. 0为参考背景， 共检测到149个靶基因，其中多个miRNA家族因其成员的成熟序列一致而靶向到同一个基 因，也存在单个miRNA成员靶向多个基因。如miR156家族靶向SBP-box基因家族，miR164 靶向3个NAC转录因子和0sFBX145。对这些靶基因进行功能预测发现，除转录调控外，这些 基因还参与物质代谢，信号转导，胁迫响应，电子传递等生命过程（如图3)。
[0062] 四