6kb)以促进DNA产量以及增大亚克隆效率，其具有C-端V5表位标签用于采用Anti-V5 抗体快速检测，并具有C-端6xHis标签用于使用镍螯合树脂来简单纯化重组融合蛋白。
[0073] 关于载体修饰技术，参见上文的Sambrook和Russel (2001)。载体可包含一个或多 个用于克隆或表达的复制和遗传系统，一个或多个用于在宿主中选择的标记，例如抗生素 抗性，以及包含一个或多个表达盒。
[0074] 被插入载体中的编码序列能够通过标准方法合成，从天然来源中分离，或作为杂 合体制备。将编码序列与转录调控元件连接（例如启动子、增强子和/或隔离子）和/或 使用已有方法与其它氨基酸编码序列连接。
[0075] 进一步地，除了本发明所述核酸序列，所述载体还包含表达控制元件，其允许编码 区在适合的宿主中适当表达。技术人员已知此类控制元件，并且此类控制元件可以包含启 动子、翻译起始密码子、翻译和插入位点或内部核糖体进入位点（IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(2001),1471-1476)以用于将插入片段引入载体。优选地，本发明核酸分 子与所述允许在真核或原核细胞中表达的表达控制序列可操作性地连接。
[0076] 本领域技术人员已知确保在真核和原核细胞中表达的控制元件。如前所述，控制 元件通常包括确保转录起始的调控序列和确保转录终止、转录子稳定的任选poly-A信号。 另外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子，和/或天然结合的或异源启动子区。允许 例如在哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控元件包括CMV-HSV胸苷激酶基因启动子、 SV40、RSV-启动子（劳斯肉瘤（Rous sarcome)病毒）、人延伸因子I α -启动子、CMV增强 子、CaM-激酶启动子或SV40-增强子。
[0077] 对于在原核细胞中表达，已记载了大量启动子，包括，例如，tac-lac-启动 子、lacUV5或色氨酸启动子。除了负责转录起始的元件，此类调控元件还可包括转录 终止信号，例如在多核苷酸下游的SV40-po Iy-A位点或tk-po I y-A。本文中，本领域已 知的适合表达载体例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDVl (Pharmacia)、pRc/CMV、 pcDNAl、pcDNA3(In-Vitrogene，尤其应用在附加实例中）、pSPORTl (GIBCO BRL)或 pGEMHE (Promega)，或原核表达载体，例如λ gtl 1。
[0078] 根据本发明的表达载体至少能够引导本发明所述核酸和蛋白的复制，优选是表 达。复制的适当起始包括例如Col E1、SV40病毒和M 13复制起始。适当的启动子包括 例如巨细胞病毒（CMV)启动子、IacZ因子、gallO启动子和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)多面体启动子。适当的终止序列包含例如牛生长激素、SV40、IacZ和AcMNPV多 聚腺苷酸化信号。可选择的标记的实例包括新霉素、氨比西林和潮霉素抗性以及类似物，优 选卡那霉素。特殊设计的载体允许DNA穿梭于不同的宿主细胞之间，例如细菌-酵母，或动 物-细菌细胞，或细菌-真菌细胞，或细菌-无脊椎动物细胞。
[0079] 除了本发明核酸分子，所述载体还可进一步包含用于编码分泌信号的核酸序列。 此类分泌信号序列为本领域技术人员熟知。进一步地，根据使用的表达系统，本发明所述的 核酸分子的编码序列中可以添加能够引导所表达多肽到细胞腔室的前导序列，并且所述前 导序列是本领域熟知的。所述前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，优选 地，前导序列能够将所翻译的蛋白或其一部分的分泌物引导入尤其是胞外膜。可选地，所述 异源序列能够编码融合蛋白，所述融合蛋白包括赋予预期特性的C-或N-端识别肽，所述预 期特性例如稳定或简化地提纯所表达的重组产品。一旦所述载体被引入到适当宿主中，所 述宿主保持在适用于核苷酸序列高表达水平的条件下，并且如期望地，随后收集和纯化本 发明蛋白、抗原片段或融合蛋白。当然，所述载体还可包含来自致病生物体的调控区。
[0080] 优选地，所述载体可以是诱导型表达载体，例如IPTG-诱导型载体。
[0081] 进一步地，所述载体除了是表达载体外还可以是基因转移和/或基因靶向载体。基 因治疗是基因转移的最重要应用之一，其基于将治疗基因（例如疫苗）通过离体或体内技 术导入细胞中。文献中记载了用于体内或体外基因治疗的适当载体、载体系统和方法，这些 也是本领域技术人员已知的；参见，例如，Giordano, Nature Medicine 2(1996),534-539 ; Schaper,Circ. Res. 79(1996), 911-919 ；Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet348(1996), 370-374 ；Muhlhauser, Circ. Res. 77(1995), 1077-1086 ；ffang,Nature Medicine 2(1996), 714-716 ；W0 94/29469 ；W0 97/00957 ；Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996) ,635-640 或 Verma, Nature 389(1997),239-242 以及其中引用的 参考文献。
[0082] 如本文上述的本发明核酸分子和载体可以被设计为用于向细胞中直接导入或用 于经由脂质体或病毒载体导入（例如腺病毒或逆转录病毒载体）。另外，杆状病毒系统或 基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒的系统能够用作本发明的核酸分子的真核表达系统。 除了重组产生，本发明所述蛋白、融合蛋白或抗原片段的片段还可以使用固相技术通过直 接的肽合成产生（参见 Stewart 等人，（1969) Solid Phase Peptide Synthesis ;Freeman Co, San Francisco ;Merrifield，J. Am. Chem. Soc. 85 (1963)，2149-2154)。体外蛋白合成可 以通过人工技术或自动化进行。可以实现自动化合成，例如按照制造商提供的指南，使用 Applied Biosystems 431A 肽合成仪（Perkin Elmer, Foster City CA)。各种片段可以分 别化学合成，然后使用化学方法组合，以产生全长分子。
[0083] 本发明还涉及包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列的宿主细胞，或包含 编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列的载体。
[0084] 所述"宿主"可以通过向宿主细胞中引入所述载体或核苷酸序列而产生，由于其在 细胞中的存在，所述宿主细胞介导本发明核苷酸序列编码的蛋白的表达，或者所述宿主细 胞包含根据本发明的核苷酸序列或载体，其中核苷酸序列和/或所编码的多肽对于宿主细 胞来说是外源的。本文使用术语"宿主"时包括宿主细胞。
[0085] "外源的"表示所述核苷酸序列和/或所编码的多肽相对于宿主来说是异源的，异 源的意味是源自具有不同基因组背景的细胞或生物体，或者相对于宿主是同源的、但是处 于与所述核苷酸序列的天然存在的对应物不同的基因组环境中。这是指，如果核苷酸序列 相对于宿主是同源的，它不位于它在所述宿主基因组中的天然位置，尤其是它被不同的基 因围绕。在这种情况下，所述核苷酸序列可以在其自身启动子的控制下或在异源启动子控 制下。技术人员通过使用本领域技术人员熟知的方法可以确认被导入的核酸分子或载体的 位置，所述方法例如DNA印迹。存在于宿主细胞中的根据本发明的载体或核苷酸序列可以 被整合到宿主基因组中，或可以在染色体外以某种形式保持。在这方面还可以理解为，本发 明核苷酸序列可以用于经由同源重组来修补或产生突变基因。
[0086] 在一个实施方案中，包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列或包含编码 根据SEQ ID N0:1的蛋白的核酸序列的载体的宿主细胞是原核或真核宿主细胞。优选 地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌BL21，例如 BL21(DE3) 〇
[0087] 适当的原核/细菌细胞是通常用于克隆如大肠杆菌、沙门氏菌、鼠伤寒、粘质沙雷 菌或枯草芽孢杆菌的那些。所述真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、昆 虫细胞、真菌细胞、植物细胞或细菌细胞（例如，大肠杆菌菌株HB101、DH5a、XLlBlue、Y1090 和JM101)。优选原核重组宿主细胞，最优选大肠杆菌。
[0088] 真核宿主细胞进一步的实例包括但不限于酵母，例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳 酸克鲁维酵母或毕赤酵母细胞，人、牛、猪、猴的细胞系和啮齿类动物起源的，以及昆虫细 胞，其包括但不限于草地夜蛾的昆虫细胞和果蝇来源的昆虫细胞以及斑马鱼细胞。源自哺 乳动物物种的细胞系适合使用并能够购买得到，包括但不限于L细胞、CV-I细胞、C0S-1细 胞（ATCC CRL1650)、C0S-7 细胞（ATCC CRL 1651)、HeLa 细胞（ATCC CCL 2)、C1271(ATCC CRL 1616)、BS-C-I (ATCC CCL 26)和 MRC-5(ATCC CCL 171)。
[0089] 所述源自果蝇属的细胞可以是果蝇属S2(ATCC CRL-1963)，优选用于果蝇属表达 系统中异源蛋白表达，例如，果蝇属表达系统（DES? )。
[0090] 源自哺乳动物物种的细胞系适合使用并能够购买得到，包括但不限于L细胞、 CV-I 细胞、C0S-1 细胞（ATCC CRL 1650)、C0S-7 细胞（ATCC CRL1651)、HeLa 细胞（ATCC CCL)、C1271 (ATCC CRL 1616)、BS-C-I (ATCC CCL 26)和 MRC-5(ATCC CCL 171)。
[0091] 在另一个更优选的实施方案中，所述两栖动物细胞是卵母细胞。在一个甚至更优 选的实施方案中，所述卵母细胞是青蛙卵母细胞，特别优选为非洲爪蟾卵母细胞。
[0092] 在一个更优选的实施例中，本根据发明的宿主是非人转基因生物体。所述非人生 物体可以是哺乳动物、两栖动物、鱼、昆虫、真菌或植物。特别优选的非人转基因动物为果蝇 属物种、秀丽隐杆线虫、非洲爪蟾的物种、斑马鱼、草地夜蛾、苜蓿银纹夜蛾、小鼠和大鼠。转 基因植物包括但不限于小麦、烟草、荷兰芹和拟南芥。本领域还熟知的是转基因真菌，其尤 其包括酵母如粟酒裂殖酵母或酿酒酵母，或曲霉菌、脉孢菌或黑粉菌物种或毕赤酵母物种。
[0093] 本发明还涉及通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列或 表达载体而得到的或可得到的蛋白，所述载体包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序 列，所述宿主细胞优选为原核宿主细胞，更优选为大肠杆菌，最优选为大肠杆菌BL21，例如 大肠杆菌BL21(D3)。
[0094] 本文描述一种用于制备由本发明所述核酸分子编码的多肽的方法，所述方法包括 培养/培育本发明所述宿主和分离所产生的多肽。
[0095] 本领域存在大量在适当宿主中产生多肽的方法。如果所述宿主为单细胞生物体或 哺乳动物或昆虫细胞，本领域技术人员能够很容易地利用培养条件，所述培养条件可以进 一步优化且无需过度劳动。很容易通过现有的方法从培养基中或从分离的（生物学的）包 涵体收获所产生的蛋白。进一步地，可以直接从宿主细胞中分离所产生的多肽。所述宿主 细胞可以是宿主生物体的一部分或源自宿主生物体的一部分，例如所述宿主细胞可以是该 组织的一部分，例如动物的CNS、皮肤等或植物的可收获部分。此外，可以从源自所述宿主的 液体分离所产生的多肽，所述液体如血液、奶或脑脊液。
[0096] 此外，本发明涉及由编码根据本发明的SEQ ID NO