包含至少两个针对her2的重复序列结构域的结合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含至少两个对人表皮生长因子受体2 (HER2)具有结合特异性的重 复序列结构域的结合蛋白质以及编码这种结合蛋白质的核酸，含有这种蛋白质的药物组合 物和这种蛋白质在疾病治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 人表皮生长因子受体 2 (HER2 ;人 HER2 的 UniProtKB/Swiss-Prot 编号为 P04626) 也称为ErbB2,是由人ERBB2基因编码的蛋白质。该基因的扩增或过度表达表现出在某 些类型的癌症的发生和发展起重要作用，并且近年来，该基因已经进展成为疾病治疗的 重要生物标记和目标。HER2是跨膜受体酪氨酸激酶（RTK)，其属于较广泛的ErbB受体 家族（Bublil，E.M.和 Yarden, Y. Curr. Opin. Cell Biol. 19 (2) ,124-34, 2007)。ErbB 受 体家族在脊椎动物中是保守的，并且包括家族奠基者ErbBl (也称为表皮生长因子受体 (EGFR)或HERl ;该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为P00533)以及最近识别 的受体HER3(也称为ErbB3 ;该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为P21860) 和HER4(也称为ErbB4 ;该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为Q15303)。所 有的ErbB受体共享广泛的序列和结构域同源性，并且形成功能性同源二聚体（例如， ErbBl-ErbBl, HER2-HER2和HER4-HER4)以及所有组合的异源二聚体。受体同源和异源二聚 化在配体结合或受体过度表达时发生并且转而通过自身磷酸化激活受体激酶结构域。这接 着触发下游胞内信号传导和生物反应。与其它ErbB受体相反，HER2不具有任何已知的配 体，并且能二聚化，在其过度表达之后，二聚化是非常明显的并且在之前没有配体结合的情 况下被激活。重要的是，HER3没有活化的胞内激酶结构域并且通过与其它ErbB受体家族 成员的异源二聚化激活，导致非常有效的下游信号传导。HER3的这种异源二聚化和激活在 配体结合至HER3时或如果合作的受体，比如HER2极大地过度表达而发生。
[0003] HER2以及其它ErbB受体家族成员由4个胞外结构域组成，该4个胞外结构域被 顺序命名为I、II、III和IV，其中结构域IV离胞外细胞膜最近并且结构域I离胞外细胞 膜最远。在配体被剥夺条件下，ErbB受体中的结构域I和III共享分子间的相互作用，该 分子间的相互作用封闭结构域II。这防止受体同源/异源二聚化和信号传导，因为二聚化 需要两个邻近的ErbB受体的结构域II之间的相互作用（Burguess A.W.,等人，Mol. Cell 12(3)，541-552, 2003)。结合配体破坏结构域I和III之间的相互作用，然后导致非激活 态-激活态受体构象变化并且使结构域II暴露。这造成该受体混杂从而与其它激活态ErbB 受体二聚化并且开始信号传导。有趣的是，HER2是唯一的组成处于激活态构象的ErbB受 体家族成员，因此，结构域II被持续暴露并可进行同源和异源二聚化。
[0004] ErbB受体二聚化和自身磷酸化导致参与正常生理以及疾病的过多的、关键的下游 信号传导分子的激活。这种被激活的信号传导分子的性质在一定程度上取决于活化的ErbB 受体二聚体的组合物。例如，HER1-HER1和HER2-HER2同源二聚体优选激活下游胞外信号调 节激酶（ERK)信号传导和增殖，而HER2-HER3异源二聚体也激活PI3K信号传导通路（包括 下游激酶AKT的激活），并由此使细胞存活。事实上，在肿瘤细胞中AKT被HER2-HER3信号传 导激活促进肿瘤细胞存活并且使肿瘤细胞抵抗HER2靶向药物，如单克隆抗体曲妥珠单抗 (Berns K.等人，Cancer Cell 12, 395-402, 2007)。有趣的是，在这些细胞中抑制HER2-HER3 介导的PI3K-AKT信号传导变成速率限制，并导致细胞死亡。除了细胞增殖和存活，HER2信 号传导还有原因地参与其它过程，比如血管生成和迀移。
[0005] HER2在约20%的所有乳腺癌中过度表达。由于其临床相关性，HER2成为第一 RTK，针对该第一 RTK研发了靶向生物制剂，即曲妥珠单抗（Herceptin?; Genentech)。该 抗体结合HER2的结构域IV并通过尚未完全了解的几种机制抑制HER2信号传导。这包括 在肿瘤细胞中诱导受体内在化，导致降低HER2表达水平和信号传导，并导致致瘤表型减 毒。曲妥珠单抗已经改变了数以万计的乳腺癌妇女的生活，扩展了她们的寿命和生活质 量。然而，曲妥珠单抗主要具有抗增殖作用并且在疾病晚期阶段肿瘤可能逃避这样的治 疗。在研发更有效的治疗的尝试中，产生了新抗体，其识别HER2的结构域II，即帕妥珠单抗 (Omnitarg?, Perjeta?; Genentech)。与曲妥珠单抗相比，该抗体不是开发成降低HER2 的膜表达水平，而是通过结合至和阻断受体二聚化结构域II干扰HER2同源二聚体和异源 二聚体的形成。帕妥珠单抗在体外和体内作为单一试剂具有意想不到的低治疗功效；然而， 其与曲妥珠单抗的组合显示协同效应。因此，两种抗体的组合可以成为乳腺癌患者的标准 护理治疗（Capelan M.，等人，Ann. Oncol.，24, 273-82, 2013) 〇
[0006] 曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合的临床前和临床成功造成这样的观点：良好的抗 肿瘤功效需要双重靶向HER2结构域II和IV。这与最近产生的同时靶向HER2的结构域II 和IV的其它分子一致。例如，丹麦公司Symphogen正在研发的针对HER2的结构域II和IV 的抗体混合物在临床前小鼠肿瘤模型已经显示出一些更高的功效（即优于单独的曲妥珠 单抗）。
[0007] 同样地，US2011/033460描述了结合HER2的结构域I和结构域IV的抗体的组合 在DNA合成和BT474细胞的存活能力上显示协同效应。此外，US2011/033460还描述了结 合HER2的两种不同表位的双特异性抗体，其中一个表位位于HER2的结构域I并且另一表 位位于HER2的结构域IV。
[0008] WO 2009/068625报道双特异性抗体（biparatopic antibody)构建体的研发，该 抗体构建体包含第一抗体结构域和第二抗体结构域，第一抗体结构域与曲妥珠单抗竞争结 合至HER2,该第二壳体结构域结合HER2的不同表位或一部分。有趣的是，一些构建体具有 SKBR3细胞增殖的拮抗作用，而另一些具有激动作用。特别是，WO 2009/068625报道双特异 性抗体构建体的研发，该抗体构建体包含第一抗体结构域和第二抗体结构域，其中该第一 抗体结构域与曲妥珠单抗竞争结合HER2 (即，结合HER2的结构域IV)，该第二抗体结构域与 帕妥珠单抗竞争结合HER2 (即，结合HER2的结构域II)。构建体，其中结合结构域IV的抗体 结构域克隆到结合结构域II的抗体结构域的N端，显示出阻断图谱激酶激活，而在其它取 向（即，结合结构域II的抗体结构域在N端）没有观察到这样阻断。总之，WO 2009/068625 描述了靶向HER2的多种双特异性抗体构建体，其在SKBR3细胞增殖或细胞信号传导上可变 地扩大效果（激动或拮抗），但没有对细胞毒性和凋亡作用进行描述。
[0009] 也描述了二价结合蛋白质，如二价双抗体分子或革El向HER2的二价亲和体 (Nielsen, U. Β·，等人，Cancer Res.，60, 6434-6440, 2000 ;Steffen，A_C.，Cancer Biother. Radiopharmaceut. 20, 239-248, 2005)。这样的分子结合两倍的相同的结合域，因此与包含 2个结合结构域（每个结合结构域结合至相同靶向分子上的不同表位）的双特异性分子不 同。
[0010] 作为抗体衍生的疗法和SMI的替代，新的结合蛋白或结合结构域可用 于特异性结合祀分子（例如，Binz, H.K·，Amstutz, P. *PlUckthun，A.，Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005)，并因此充当拮抗剂。一种不具有Fe的这类新型结合 蛋白或结合结构域基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域（W0 2002/020565; Binz, Η. K. , Amstutz, P. , Kohl, A. , Stumpp, Μ. T. , Briand, C. , Forrer, P. , Griltter, M. G.，和 PlUckthun, A.，Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004 ;Stumpp, Μ. T.，Binz, H. K 和 Amstutz，P·，Drug Discov. Today 13,695-701,2008)。
[0011] W02002/020565描述了如何构建重复序列蛋白的大文库及其一般应用。这些设 计的重复序列结构域利用重复序列蛋白的模块化性质，并且可以具有N端和C端加帽模 块，以防止设和PlUckthun，A.，FEBS letters 539, 2-6, 2003)。该新型结合蛋白包括设 计的锚蛋白重复序列蛋白（DARPin)。之前描述了结合至HER2的单特异性DARPin的产 生（例如，Steiner, D.，Forrer, P.和 PlUckthun，A.，J. Mol. Biol. 382, 1211-1227, 2008 ; Zahnd, C. , Pecorari, F. , Straumann, N. , Wyler, E.和 PlUckthun, A. , J. Biol. Chem. 281(46), 35167-35175, 2006)。
[0012] 最近，描述了设计的双特异性锚蛋白重复序列蛋白，其靶向HER2(Jost，Ch.,等 人，Structure 21，1-13, 2013)。作者表示通过短接头（长接头不能达到同样好的效果）连 接使两个锚蛋白重复序列结构域（一个靶向HER2的结构域I并且另一靶向HER2的结构域 IV)结合相比单独的靶向HER2的结构域IV的曲妥珠单抗在BT474细胞上导致更强的细胞 毒性作用。该特异性重复序列蛋白通过2个HER2分子的分子内交联而起作用，即，其连接 两个膜结合型HER2分子，使其扭曲，从而使其不能与任何EGFR家族成员形成能进行信号传 导的二聚体，防止任何激酶的二聚化，并因此导致所观察到的细胞毒性作用。
[0013] 即使现有技术表明HER2的靶向有利于疾病，例如癌症的治疗，还明确需要产生较 高效地靶向HER2的结合蛋白。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是提供HER2的新拮抗剂。
[0015] 本发明的另一个目的是提供抑制HER2相关的细胞信号传导的新机制。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种在细胞（例如，肿瘤细胞）、组织、器官或患者中抑 制HER2介导的细胞增殖和/或诱导凋亡的新方法。
[0017] 本发明的另一目的是提供利用双特异性重复序列蛋白处理HER2的两个结构域的 单一治疗方法。
[0018] 本发明的另一目的是提供癌症治疗的新选择。
[0019] 本发明的另一目的是提供针对肿瘤疾病的治疗，该治疗具有良好的功效和/或副 作用小。
[0020] 本发明的另一目的是提供一种针对肿瘤疾病的可供选择的治疗，该治疗不会（或 仅部分地）对现有技术的疗法有反应，或有抗性。
[0021] 发明概要
[0022] 这些目的通过独立权利要求的主题实现，从属权利要求以及说明书进一步公开优 选的实施例。
[0023] 虽然附图和前面的描述更详细地展示和描述了本发明，这些展示和描述被认为是 解说或示例而非限制，本发明不限于已公开的实施例，在实践本发明时，本领域技术人员可 以从附图、公布和权利要求的学习中明白并实现公布的实施例的其它变形。在权利要求中， 术语"包含"不排除其它元件或步骤，并且不定冠词"一"或"一个"不排除多个。在仅凭某 些措施被记载在相互不同的从属权利要求中并不表示这些措施的组合不能被有利地使用。 权利要求的任何附图标记不能解释为限制本发明的范围。
【附图说明】
[0024] 图 I. DARPin 与 HER2 结合
[0025] 如图IA和IB所示，利用纯化的HER2结构域（结构域I、结构域III-IV或结构域 Ι-ΙΠ )作为竞争者通过竞争ELISA测试单价DARPin与HER2胞外结构域（结构域I-IV)的 结合。存在500nM Her2结构域I的情况下，DARPin#51和DARPin#52不可以结合HER2 (结 构域I-IV)，表明其结合在结构域I上的表位。DARPin#7、DARPin#53和DARPin#54结合结 构域Π ，因为500nM Her2结构域I或500nM Her2结构域III-IV都不能防止其结合至全长 Her2 (结构域I-IV)。图IC展示了单价DARPin可以结合在预先形成的HER2-帕妥珠单抗 复合体上并且，与帕妥珠单抗结合HER2结构域II相比，结合HER2上的不同的表位。参下 文DARPin的定义。OD，在450nM的光密度减去620nm的OD ;C对照DARPin，其不结合HER2 ; dl，HER2 的结构域 I ;dl-3, HER2 的结构域 I-III ;d3-4, HER2 的结构域 III-IV。
[0026] 图2.单价和双特异性结合蛋白对BT474细胞增殖的抑制作用
[0027] 测试单价DARPin ( g卩，DARPin#l和DARPin#18)、这些单价DARPin的非共价混合物 和包含在不同取向的这些单价DARPin的双特异性结合蛋白（DARPin#41和DARPin#49)对 BT474增殖的抑制。图2A展示了不同浓度的双特异性DARPin对增殖的抑制作用并且对不 同的单个实验展示了相应的抑制拟合曲线。接着计算DARPin#41的IC 5tl值为约2nM。表2 列举了不同的DARPin的IC5tl值。图2A展示了 OD，在450nM的光密度减去620nm的OD针对 C、DARPin浓度（nM)绘图。X轴以对数标度显示。图2B展示了双特异性DARPin的浓度为 IOOnM的双特异性DARPin、单价DARPin二者的混合物和单独的相应的单价DARPin对增殖 的抑制。OD绘制在Y轴。低OD反映抑制增殖。参见下文对DARPins. #41、DARPin#41;#49、 DARPin#49 ;#18、DARPin#18 ;#l、DARPin#l 的定义；n. c.负对照。
[0028] 图3.各种双特异性DARPin对ΒΤ474细胞增殖的抑制
[0029] 该图展示了包含不同N端和/或C端锚蛋白重复序列结构域的双特异性 DARPin (#23, #24, #33, #37, #43, #44和#41)分组对ΒΤ474增殖的抑制。对于各不同的单个 试验展示了不同浓度的DAPRin对增殖的抑制作用以及相应的抑制拟合曲线。表2列举了不 同DAPRin的IC 5tl值。图3Α展示了具有DARPin#15的双特异性DARPin的抑制作用并且图 3B展示了 DARPin#18在C端的双特异性DARPin的抑制作用。图3C和3D展示了 DARPin#51 在N端和DARPin#18在C端的双特异性DARPin的抑制作用，并且图3D展示了 DARPin#51 在N端和DARPin#21在C端的双特异性DARPin的抑制作用。曲线图展示了 0D，在450nM 的光密度减去620nm的0D，针对C、DARPin浓度（nM)绘图。X轴以对数标度显示。参见 下文对 DARPins. #23、DARPin#23 ;#24、DARPin#24 ;#33、DARPin#33 ;#37、DARPin#37 ;#41、 DARPin#41 ;#43、DARPin#43 ;#44、DARPin#44 的定义。
[0030] 图4.在不同的细胞系中双特异性DARPin#41对细胞增殖的抑制
[0031] 测试DARPin#41和曲妥珠单抗对NCI-N87 (图4A)和ZR75-30 (图4B)以及 MDA-MB175(图4C)增殖的抑制作用。对于各不同的单个试验展示了不同浓度的DAPRin对 增殖的抑制作用以及相应的抑制拟合曲线。表3列举了不同细胞系的IC 5tl值。曲线图展示 了 0D，在450nM的光密度减去620nm的0D，针对C、DARPin浓度（nM)绘图。X轴以对数标 度显示。参见下文对DARPin和相关分子#41、DARPin#41 ;T、曲妥珠单抗的定义。
[0032] 图5.在不同细胞系中双特异性DARPin#41对凋亡的诱导
[0033] 测试在BT474细胞（图5A)和NCI-N87细胞（图5B)以及MDA-MB175 (图5C)中 DARPin#41和曲妥珠单抗对凋亡的诱导。对于各不同的单个试验展示了不同浓度的DAPRin 对凋亡的诱导以及相应的抑制拟合曲线。表3列举了不同细胞系的EC5tl值。图5A的曲线图 展示了 0D，在450nM的光密度减去490nm的0D，针对C、曲妥珠单抗或DARPin浓度（nM)绘 图。图5B和5C的曲线图展示了 RLU，相对光度单位针对C、曲妥珠单抗或DARPin浓度（nM) 绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin ;T、曲妥珠单抗；#41、DARPin#41的定义。
[0034] 图6.比较DARPin#41和基准对细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导的功效
[0035] 测试DARPin#41和基准曲妥珠单抗和帕妥珠单抗以及IOOnM曲妥珠单抗和滴定的 帕妥珠单抗的组合对BT474细胞的增殖抑制作用和对凋亡的诱导。图6A展示了对于各不 同的单个试验各种浓度的DARPin，各基准浓度对增殖的抑制作用，以及相应的抑制拟合曲 线。表3列举了不同细胞系的IC 5tl值。该曲线图展示了 0D，在450nM的光密度减去620nm 的0D，针对C、DARPin/基准浓度（nM)绘图。X轴以对数标度显示。图6B展示了对于各不 同的单个试验，不同浓度的DARPin，各基准浓度对凋亡的诱导，以及相应的激活拟合曲线。 表3列举了不同细胞系的EC 5tl值。该曲线图展示了相对光度单位（RLU)针对C、DARPin/基 准（nM)浓度绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin ;T、曲妥珠单抗；P、帕妥珠单 抗；#41、DARPin#41 的定义。
[0036] 图7.不同形式的双特异性结合蛋白对BT474细胞增殖的抑制作用
[0037] 该图展示了由在N端的DARPin#l和在C端的DARPin#18组成的不同形式的双特异 性DARPin对BT474增殖的抑制作用。图7A展示了对于不同的单个试验，各种浓度的双特异 性DARPin (该双特异性DARPin被改造成具有长血清半衰期）对增殖的抑制以及相应的抑 制拟合曲线。双特异性DARPin#63在其C端Cys残基被聚乙二醇化，而双特异性DARPins#64 和#65包含结合至血清白蛋白的锚蛋白重复序列结构域。图7B展示了对于不同的单个试 验，在结合HER2的重复序列结构域之间含有不同接头的不同浓度的双特异性DARPin对增 殖的抑制以及相应的抑制拟合曲线。表2列举了 DARPin的IC5tl值。该曲线图展示了 0D，在 450nM的光密度减去620nm的0D，针对C、不同浓度的DARPin (nM)绘图。X轴以对数标度显 示。参见下文对DARPin ;#66、DARPin#66(其在两个重复序列结构域之间包含2个氨基酸长 度的短GS-接头）；#67、DARPin#67 (其在两个重复序列结构域之间包含5个氨基酸长度的 GS-接头）；#41、DARPin#41 (其在两个重复序列结构域之间包含10个氨基酸长度的GS-接 头）；#68、DARPin#68(其在两个重复序列结构域之间包含24个氨基酸长度的PT-接头）的 定义，
【具体实施方式】
[0038] 根据本发明的一个实施例，重组结合蛋白包含至少第一和第二重复序列结构域， 其中所述两个重复序列结构域中的每个结合HER2的胞外区，并且其中所述重复序列结构 域是通过共价键连接的。
[0039] 已经令人惊讶地证明HER2的胞外部分与包含至少两个共价连接的重复序列结构 域（每个共价连接的重复序列结构域对HER2的胞外区具有特异性）的重组结合蛋白的结 合比上文概括的现有技术的方法[通过不同和单独的结合物（例如，曲妥珠单体和帕妥珠 单体的组合；图6)结合HER2]具有优势和意想不到的效果。
[0040] 人HER2由1255个氨基酸组成，其中21个氨基酸的信号序列、631个氨基酸的胞外 区（例如，包含结构域I至IV的胞外域）、23个氨基酸的跨膜区，以及580个氨基酸的胞浆 结构域。
[0041] 优选地，HER2的胞外区与所述重组结合蛋白的结合和所述重复序列结构域结合至 HER2的胞外区是同时发生的或并行发生的。同样优选地，所述重复序列结构域结合至HER2 胞外区的2个不同的表位。同样优选地，所述重复序列结构域结合至HER2胞外区的2个不 同的非覆盖型表位。
[0042] 功效增加的一个原因可能是根据本发明的重组结合蛋白诱导迄今未描述的HER2 胞外区的非激活态构象，这似乎是本发明的双特异性结合蛋白与HER2胞外区上的2个不同 表位的分子内相互作用的结果（实施例8) ;即，该结合蛋白的2个重复序列结构域似乎都 同时结合至相同的HER2分子上的不同表位，并且从而迫使HER2的胞外区处于这种新的非 激活态构象中。现有技术没有描述这种非激活态构象。重要的是，这2个重复序列结构域 需要连接在相同的结合蛋白中，即，这两个重复序列结构域的简单混合不表现出疗效（图 2B)。此外，这种结合蛋白与HER2胞外区的二价结合可以通过显示增加的亲合力（即，同步 结合至靶的不同表位的组合强度）产生协同结合效果。亲合力与亲和力不同，其对应单个 的结合相互作用的强度。总之，如实施例所示，该结合蛋白与HER2的特异性相互作用可以 解释通过这些分子对增殖非常有效的抑制作用和对凋亡的诱导。
[0043] 根据这些理论，在相同蛋白中的2个不同的重复序列结构域协同地支持彼此结合 其各自的表位，从而导致对靶的总亲和力增加。
[0044] 第一重复序列结构域结合至HER2上的表位使得第二重复序列结构域进入积极和 /或空间有利的位置，这促进该第二重复序列结构域与HER2上其单独的表位结合。
[0045] 如实施例所示，该第一和第二重复序列结构域的共价连接似乎增强其生物活性。
[0046] 在根据本发明的重组结合蛋白的优选实施例中，第一重复序列结构域结合HER2 的结构域Π 并且第二重复序列结构域结合HER2的结构域IV。
[0047] 重点要了解的是，术语"结合结构域II"意味着单独的重复序列结构域主要结合 HER2的结构域II。但是，这个定义并不排除所述重复序列结构域的部分可以与其它结构域 结合，或相交。这同样适用于术语"结合结构域IV"。
[0048] 根据本发明的双特异性结合蛋白同时靶向HER2的结构域II和IV比现有技术中 的已知技术具有特别意想不到的效果。在这些结合蛋白抑制增殖和诱导细胞凋亡的情况下 的细胞应答相比现有技术的抗体获得的效果要更加明显的多。例如，这些应答的程度已经 证明优于临床抗体基准[比如，分别靶向HER2的结构域IV和II的曲妥珠单抗和帕妥珠单 抗的组合（图4、5和6)]诱导