具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种血管性血友病因子裂解酶的突 变体ADAMTS13-MDTCS与人血清白蛋白HSA的融合蛋白、制备方法及其在制备治疗血栓性血 小板减少性紫癜（TTP)药物中的应用。
【背景技术】
[0002] I. 1血栓性血小板减少性紫癜
[0003] 血检性血小板减少性紫癒（thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)是一 种微血管血栓出血综合征，是因为血小板大量消耗而减少，在血液微循环中形成了血小板 血栓，临床特征表现为在皮肤表面形成紫癜。微血管溶血性贫血和血小板减少是本疾病最 核心的两大特征，另外或伴有神经系统损伤、肾脏损害及发热表现。临床上TTP分先天性 TTP (基因突变）和获得性TTP (产生自身抗体）。TTP临床表现预后差，病程短，死亡率高， 达80%~90%，TTP缓解后复发率较高，为30%~60%。在TTP临床治疗方面，目前尚无 特效药，治疗通常采用血浆置换疗法或全血置换疗法，此类治疗方法费用高昂，过程复杂， 且副作用较多，临床上存在交叉感染等诸多风险。因此，TTP的新型药物的研发成为治疗本 病的关键。
[0004] I. 2ADAMTS13 与 TTP
[0005] 血管性血友病因子裂解酶（A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type Repeats 13, ADAMTS13)是 ADAMTS 家族的成员之一，属于金属蛋 白酶。ADAMTS13基因位于9号染色体长臂（9q34)，cDNA全长4597kb，由29个外显子组 成，开放阅读框为4284bp，编码1427个氨基酸。ADAMTS13蛋白由肝脏内皮细胞合成并分 泌到血液中，其主要功能是剪切在新生的富血小板血栓内的血管性血友病因子（VWF因 子），以防止溶血、血小板减少和组织梗塞。该酶在正常机体内可以特异性地裂解VWF-A2 区的Tyrl605-Metl606之间的肽键，从而使VWF裂解，保持正常的止血和血循环功能。当 ADAMTS13缺乏或活性减低时，不能够有效的裂解VWF与血小板糖蛋白结合形成的超大分子 量VWF (UL-VWF)分子时，便使之形成富含血小板和VWF的血栓，导致TTP的发生。由于发现 TTP发病与ADAMTS13蛋白酶的功能缺失密切相关，因此ADAMTS13重组蛋白成为治疗TTP疾 病的新的研宄方向。目前，体外表达ADAMTS13基因，获得功能性的ADAMTS13重组蛋白，仍 处于实验研宄阶段。
[0006] I. 3ADAMTS13 全长蛋白（ADAMTS13-FL)与 ADAMST13 截断型突变体 (ADAMTS13-MDTCS)
[0007] ADAMTS13作为ADAMTS家族一员，ADAMTS13-FL包含以下公共结构域，分别是信号 肽（signal sequence, SP)，前导肽（propeptide, P)，金属蛋白酶结构域（metalIoprotease domain, Μ)，去整合素样结构域（disintegrin-like domain, D)，I型血小板反应蛋白重复序 列（thrombospondin typel, TSPl)，富含半H光氨酸结构域（cysteine-rich domain, C)，空间 结构域（spacer domain, S)，空间结构域后面是7个TSPl重复序列，和ADAMTS13特有的2 个CUB结构域。
[0008] ADAMTS13-MDTCS则包含除了 7个TSPl重复序列和ADAMTS13特有的2个CUB结构 域，其他功能结构域，分别是信号肽，前导肽，金属蛋白酶结构域，去整合素样结构域，I型血 小板反应蛋白重复序列，富含半胱氨酸结构域，空间结构域，取每个结构域的首字母，因此 称作MDTCS突变体。
[0009] 有研宄报道ADAMTS13-MDTCS拥有与ADAMTS13-FL同等的生物学功能，但是 ADAMTS13-MDTCS蛋白大小远远小于ADAMTS13-FL，因此体外表达生产蛋白的难度更小，预 期的产量也较大，另外更重要的一点是：设计具有蛋白裂解活性但又不被ADAMTS13抗体所 抑制的ADAMTS13重组体蛋白是解决获得性TTP的关键，可以有效降低ADAMTS13抗体治疗 失败的风险，也有效减少获得性TTP患者血浆置换治疗的频率。
[0010] 但是，根据前期的实验结果，ADAMTS13-MDTCS蛋白在小鼠体内的半衰期实验表明， ADAMTS13-MDTCS蛋白半衰期较短，均在2小时之内，与正常血浆中ADAMTS13蛋白的半衰期 1-2天，差距较大，半衰期较短减少了药物有效窗口期，降低了本实验室开发TTP治疗蛋白 药物的可能性，因此，有效延长ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期将能使得ADAMTS13-MDTCS蛋 白具有更好的临床应用前景。
[0011] 1. 4现有延长蛋白药物半衰期的方法
[0012] 目前，延长蛋白药物半衰期主要根据加大蛋白药物的分子量，有效减少肾小球滤 过率，相对分子质量小于69 000的分子都将通过肾小球滤过作用被排出体外；减少异源蛋 白的免疫原性，防止被蛋白酶水解，从而减少其体内清除率；持续缓慢释放维持药物浓度， 延长药物作用时间等三个方面考虑。常用技术包括：PEG化学修饰、制备缓释剂型、蛋白基 因融合技术等。
[0013] 1.4. 1化学修饰法
[0014] 化学修饰法是延长蛋白药物半衰期的一个重要方法之一，其延长蛋白药物半衰期 的原理主要包含以下两部分内容：1)蛋白质药物经过化学法修饰以后，其化学分子量得到 一定程度的增加，因此在代谢过程中降低了被肾小球过滤的机会；2)把蛋白药物的非必需 基团与亲水惰性的化学高分子共价结合，进而将蛋白药物的抗原决定簇屏蔽，大大降低了 作为异源性物质在体内被免疫系统识别的几率，也就不产生相应抗体，解除异体蛋白免疫 原性，从而大大降低了蛋白药物被蛋白酶水解的机会。目前使用的蛋白药物修饰剂包含以 下试剂：PEG、肝素、聚氯基酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷、多聚唾液酸等，其中以PEG修饰 剂最为常用。已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的IFNa 2a(商品名Pegasys，生产商 Roche)，PEG 化的 IFN a 2b (商品名 PEGIntron，生产商 Schering)，和 PEG 化的 G-CSF (商品 名 Neulasta，生产商 Amgen)等。
[0015] PEG修饰后的蛋白具有热稳定性好，体内半衰期显著延长，不易被体内蛋白酶水 解，毒性减小，免疫原性与抗原性显著降低等优点，但本方法也存在许多缺点，例如，1)修 饰反应工艺复杂，需要选择合适分子量的PEG修饰不同位点的游离氨基，控制修饰反应的 条件，从而筛选最佳修饰方案；2)化学修饰后蛋白药物纯化困难，收率低；3)由于PEG为 非单一化合物，分子量的概念是平均分子量，因此，反应终产品是一组异构体组成的混合 物，对人健康的长效影响很难衡量；4)化学修饰后，封闭住了某些蛋白基团，降低了蛋白基 团之间的相互联系，导致蛋白质的比活性明显下降。
[0016] 1.4. 2缓释剂法
[0017] 缓释剂是指通过某种剂型延缓药物释放的速率，进而降低药物进入机体的吸收速 率，最终取得长期的药物治疗效果。主要分为两大类：以微球为代表的聚合体给药系统，以 脂质体为代表的脂类缓释系统。
[0018] 微球是指将药物溶解或分散在高分子材料中形成微小球状实体，其粒径范围通常 在1~250_。把蛋白药物或多肽类药物包封于微球载体中，通过皮下给药或肌内给药，使 药物缓慢释放，药物在体内的有效作用时间可长达1~3个月。用于制备缓释微球的材料 主要是在进入机体后能逐渐被分解的高分子聚合物，大致可分为天然聚合物和人工合成聚 合物两类。脂质体是将药物包裹于类脂质双分子层所形成的超微型球状囊泡，它作为多肽 和蛋白质类药物的载体可起到保护药物活性，提高稳定性，延长半衰期和延缓释放的作用。 脂质体根据其结构和所包含的双层磷脂膜层数，可分为单室脂质体和多室脂质体。两种缓 释剂法已经被广泛使用，目前，已经有LHRH、hGH等多种蛋白质和多肽的缓释微球制剂上市 销售。
[0019] 蛋白质多肽类药物的缓释微剂法不仅大大减少了给药频率，也有效避免药物浓度 的峰谷变化导致的不良作用，而且能够增加药物的稳定性和靶向性，减少药物对周围组织 及非靶位组织细胞的毒副作用等。但是，该技术尚需进一步优化，不足之处包括：大量药物 一次性植入体内，患者额外承担了药物突然释放的毒性风险；蛋白药物长期包裹植入体内， 蛋白药物的生物活性一致性无法保障等。
[0020] 1.4. 3基因融合法
[0021] 基因融合法是选取与人体相容性好，无毒副作用，不易引起免疫清除，分子量大且 半衰期长的蛋白作为载体蛋白，将目的蛋白与其融合，利用载体蛋白分子量大的性状将目 的蛋白的非活性区域折叠包裹，仅暴露出活性部位，从而保留目的蛋白的生物作用并在体 内缓慢释放药物，达到延长药物半衰期的目的。
[0022] 目前，关于如何在保证原有蛋白ADAMTS13-MDTCS的生物学活性的同时，有效延长 ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期方面的技术，尚未见明确的报道。
【发明内容】
[0023] 本发明目的之一在于提供一种具有延长的半衰期的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白、 及其对应的核苷酸序列、载体及宿主细胞。
[0024] 本发明的目的之二在于提供上述融合蛋白的制备方法。
[0025] 本发明的目的之三在于提供一种治疗血栓性血小板减少性紫癜（TTP)的药物。
[0026] 本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
[0027] 发明提供了一种ADAMTS13-MDTCS融合蛋白，包含人血清白蛋白HSA和血管性血友 病因子裂解酶的突变体ADAMTS13-MDTCS，所述人血清白蛋白HSA位于所述血管性血友病因 子裂解酶的突变体ADAMTA13-MDTCS的C-端。
[0028] 所述人血清白蛋白HSA与所述血管性血友病因子裂解酶的突变体 ADAMTA13-MDTCS通过连接肽连接。
[0029] 连接肽是连接目标蛋白与人血清白蛋白HSA之前的部分，其保证蛋白两部分有必 要的间隔，保持蛋白活性必需的空间构象，并且避免融合蛋白两部分产生相互作用。连接 肽主要由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸组成，通用的连接链为甘氨酸和丝氨酸的重复序 列。在构建融合蛋白时连接肽的长度对蛋