含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统及方法。
【背景技术】
[0002]胶原酶灌流法是目前主要的原代肝细胞分离方法。该法通过既有脉管系统对大块肝组织进行胶原酶灌流，或者对小块肝组织进行多点位穿刺针穿刺胶原酶灌流等方法获取原代肝细胞。分离的肝细胞悬液通过滤网初步筛除较大的组织块、筋膜等，然后采用密度梯度离心的方法获得较纯的肝细胞。当前我国病毒性肝炎、肝硬化发病率仍居于高位，代谢性肝病发病率逐年上升，肝脏疾病仍是威胁健康的主要疾病，肝脏疾病的研宄和治疗对于原代肝细胞的需求量日益增大。特别是生物人工肝研发工作及将来可能的临床应用，需要大量的纯度较高的原代肝细胞。
[0003]而目前国内采用胶原酶灌流获得原代肝细胞的操作方法，缺乏一整套系统的灌流装备，在操作过程中存在以下不足之处:1、肝组织无专有的固定装置，人工用手固定小块肝组织进行多位点穿刺的时，有发生针刺伤的风险。特别是在从事科学研宄，分离病毒性肝炎等血源性传染病患者肝脏组织原代肝细胞时，若发生针刺伤职业暴露，可导致操作者感染相应的病原体；2、肝组织无专有的固定装置，胶原酶灌注过程中，容易发生肝组织移位、灌注喷头脱离、液体喷溅的情况，这些液体喷溅至眼结膜等部位，可发生粘膜职业暴露；3、缺乏多层滤过系统，需要复杂的密度梯度离心才能获得纯度较高的原代肝细胞；以及为防止阻塞，含胶原酶的灌流液不能循环利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统及方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统，由肝组织固定装置、多层滤过装置、磁力搅拌器、第一蠕动泵、储液容器和第二蠕动泵组成，所述肝组织固定装置设置在多层滤过装置内，肝组织固定装置和多层滤过装置之间通过管道依次连接第一蠕动泵、储液容器和第二蠕动泵；
所述肝组织固定装置是由多个固定板和活动板组成的中空正方体结构，所述固定板和活动板上均开有筛孔，所述固定板包括紧密衔接的第一固定板、第二固定板和第三固定板均不能活动，第一固定板、第二固定板和第三固定板共同构成立方体的三个固定面；所述活动板包括第一活动板和第二活动板，第一活动板通过第一滑轮在第二滑轮轨道上滑动，第二活动板通过第二滑轮在第一滑轮轨道上滑动，第一活动板上设有多个间隔相等的交叉缝，交叉缝的一端封闭且与第一活动板主体相连，交叉缝的另一端开放且容纳第二活动板穿过，第一活动板和第二活动板构成立方体的两个活动面；第二固定板和第二活动板上均开设有位于筛孔之间的固定孔，固定孔中穿设有固定片，多个固定片穿入固定孔中后形成立方体的一个面；所述第一滑轮和第二滑轮上均设有滑轮开关；
所述多层过滤装置由中空圆柱形的端盖部、中间部和底部三部分组成，所述端盖部内设有立方体的中空空间，且中空空间与肝组织固定装置吻合，端盖部的内部下端设有第一筛网，端盖部的下端还设有端盖部螺纹，所述中间部的顶端设有与端盖部螺纹衔接的上端螺纹，端盖部螺纹与上端螺纹形成第一螺纹连接处；所述中间部的内部设有第二筛网，第一筛网与第二筛网形成的空间为细胞团容纳腔体，所述第二筛网上放置有第一磁珠，所述中间部的下端设有下端螺纹，所述底部的顶端设有与下端螺纹衔接的底部螺纹，下端螺纹和底部螺纹形成第二螺纹连接处，所述底部的内部设有第三筛网，第二筛网与第三筛网形成的空间为细胞富集腔体，所述第三筛网上放置有第二磁珠，位于第三筛网的底部内空间为灌流液暂储腔体，所述底部的侧壁上设有液体出口。
[0006]作为本发明进一步的优选方案:所述第一筛网、第二筛网和第三筛网的孔径依次减小。
[0007]作为本发明再进一步的优选方案:所述固定板、活动板和固定片由金属材料、不锈钢或聚碳酸酯制成；所述多层过滤装置的外壳由透明的聚碳酸酯材料制成。
[0008]含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统的分离方法，具体步骤如下:
(1)肝组织固定
先对反应器各部件进行灭菌处理，分离肝细胞的各步骤均在无菌的超净台实验室中进行，将肝组织放置在三个固定板围成的空间内；安装第二活动板，沿着第一滑轮轨道滑动第二活动板直至压紧肝组织，然后锁闭第一滑轮；安装第一活动板，使得第二活动板在合适位置穿过交叉缝，沿着第二滑轮轨道滑动第一活动板直至压紧肝组织，然后锁闭第二滑轮；在第二活动板及第二固定板上的固定孔中贯通插入固定片，由此形成六个面的立方体固定装置用于固定用于细胞分离的的肝组织；
(2)系统的组装
将端盖部、中间部和底部通过相应的螺旋组装好，并放置第一磁珠和第二磁珠，以形成多层滤过装置；将固定有肝组织的肝组织固定装置放置在中空空间内，并液体管路连接好蠕动泵、磁力搅拌器和储液容器；
(3)肝组织胶原酶灌流液灌流
灌流喷头通过筛孔插入肝组织脉管中，或通过穿刺针多点位刺入肝组织中，打开第二蠕动泵，将储液容器中胶原酶灌流液灌流至肝组织中，在胶原酶的作用下肝组织中的肝细胞逐渐分离，并随灌流液往下流，当多层滤过装置液面超过第一网筛高度时，打开磁力搅拌器调节转速，使第一磁珠和第二磁珠缓慢旋转，并立即打开第一蠕动泵，以相应第一蠕动泵相应的速度将灌流液暂储腔体中的灌流液通过液体出口排出并回流至储液容器中；灌流过程中，可去除固定片，并通过刀片切割帮助肝细胞充分解离；
(4)原代肝细胞收集
灌流结束时停止第二蠕动泵，第一蠕动泵继续工作，抽吸多层滤过装置中的灌流液，当灌流液液面低于第二螺纹连接处高度时停止抽吸，并停止磁力搅拌器工作，按螺纹拧开分离中间部和底部，用移液器转移原代肝细胞悬液至相应的容器内，以进一步离心获得原代肝细胞。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
1、本发明提供一整套结构完善的从肝组织中分离原代肝细胞的装置系统，简便、快捷、经济的获得纯度较高的原代肝细胞；
2、可固定肝组织，避免徒手固定肝组织，多点位穿刺针穿刺时，发生针刺伤；
3、固定肝组织，避免肝组织发生位移，引起灌流液飞溅；
4、存在多层滤过系统，滤过后的胶原酶灌流液，可重复灌流于肝组织，可减少胶原酶的用量，节约成本。
【附图说明】
[0010]图1为本发明的实施示意图。
[0011]图2为本发明中肝组织固定装置的结构示意图。
[0012]图3为肝组织固定装置中第一固定板、第三固定板的横截面示意图；
图4为肝组织固定装置中第三固定板、第二活动板的横截面示意图；
图5为肝组织固定装置中固定片的横截面结构示意图；
图6为肝组织固定装置中第一活动板的横截面示意图；
图7为本发明中多层滤过装置的分体结构示意图。
[0013]图8为本发明中多层滤过装置的整体结构示意图。
[0014]图中:1_第一固定板；2_固定孔；3_第二滑轮轨道；4_第一滑轮；5_第二固定板；6-肝组织固定装置；7_第三固定板；8_第二活动板；9_第一活动板；10_交叉缝；11_第一滑轮轨道；12-第二滑轮；13_筛孔；14_固定片；15_中空空间；16-端盖部；17-第一筛网；18_端盖部螺纹；19_上端螺纹；20_中间部；21_第二筛网；22_下端螺纹；23_第一磁珠；24_底部螺纹；25_底部；26_第三筛网；27_液体出口 ；28_灌流液暂储腔体；29_第二磁珠；30_第一螺纹连接处；31_细胞团容纳腔体；32_第二螺纹连接处；33_细胞富集腔体；34-磁力搅拌器；35_磁力搅拌器调速按钮；36_多层滤过装置；37_肝组织；38_第一蠕动泵；39_储液容器；40_第二蠕动泵。
【具体实施方式】
[0015]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0016]请参阅图1?8，本发明实施例中，含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统，由肝组织固定装置、多层滤过装置、磁力搅拌器、第一蠕动泵、储液容器和第二蠕动泵组成，其特征在于，所述肝组织固定装置设置在多层滤过装置内，肝组织固定装置和多层滤过装置之间通过管道依次连接第一蠕动泵、储液容器和第二蠕动泵。
[0017]肝组织固定装置6是由多个固定板和活动板组成的中空正方体结构，固定板、活动板和固定片由金属材料、不锈钢或聚碳酸酯制成；固定板和活动板上均开有筛孔13，所述固定板包括紧密衔接的第一固定板1、第二固定板5和第三固定板7均不能活动，第一固定板1、第二固定板5和第三固定板7共同构成立方体的三个固定面；活动板包括第一活动板9和第二活动板8，第一活动板9通过第一滑轮4在第二滑轮轨道3上滑动，第二活动板8通过第二滑轮12在第一滑轮轨道11上滑动，第一活动板9上设有多个间隔相等的交叉缝10，交叉缝10的一端封闭且与第一活动板9主体相连，交叉缝10的另一端开放且容纳第二活动板8穿过，第一活动板9和第二活动板8构成立方体的两个活动面；第二固定板5和第二活动板8上均开设有位于筛孔之间的固定孔2，固定孔2中穿设有固定片14，多个固定片穿入固定孔2中后形成立方体的一个面。
[0018]第一滑轮4和第二滑轮12上均设有滑轮开关，当运动至所需要的位置后，锁闭滑轮开关，将活动板固定于固定板上，通过固定板和活动板的搭配，并根据肝组织大小，实现立方体空间的扩大和缩小，以更好的固定肝组织。
[0019]肝组织固定装置6为中空可调节大小的立方体构型，其中的固定板和活动板的数量可调整。对于本固定装置固定板和活动板数量调整，形成大小可调节中空立方体构型的肝组织固定装置均视为本发明专利的保护范围。
[0020]多层过滤装置36由中空圆柱形的端盖部16、中间部20和底部25三部分组成，多层过滤装置的外壳由透明的聚碳酸酯材料制成，可以方便的观察储液池和内腔液面的高度；该装置总高度为10cm，除端盖部16外，内空圆柱形的直径为8cm，总容积约为500ml。
[0021]端盖部16内设有立方体的中空空间15，且中