一种解淀粉芽孢杆菌hn-11及其菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物农药和植物保护领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株HN-Il 和它的微生物菌剂的制备方法，及其在植物病虫害防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 印楝渣是杀虫植物印楝种子经提取印楝素后的副产品，由于利用率低，通常作为 废弃物丢弃，这极大浪费了能作为植物病虫害防治产品的原料。我们的研究发现印楝渣本 身仍然含有少量具有杀虫、抗菌作用的活性成分，但是现有技术中，印楝渣如果直接使用， 少量时防病效果不佳，大量（大于5% )使用会造成植物伤苗现象，因此通过合适方法使其 完成腐熟过程是有必要的。
[0003] 另一方面，鉴于印楝渣还含有大量的有机物质和植物蛋白等营养成分以及纤维， 可用作生防菌的培养基原料和吸附载体，将生防菌添加到印楝渣中，不仅可以加快其腐熟 进程，同时印楝渣的养分可以保证生防菌大量生长繁殖，并作为生防菌的载体，两者辅助作 用既可克服印楝渣直接大量使用伤苗的难题，又可扩大防治谱，同时利用印楝渣提供的养 分促进植物生长。鉴于印楝渣含有少量抗菌作用活性成分，筛选到与其兼容而又具有防病 的菌株尤为重要。
[0004] 基于以上思路和技术要求，本发明人从印楝树的根际土壤分离到一株解淀粉芽孢 杆菌HN-11，将其与印楝渣固体培养基二次发酵，并以印楝渣作为菌剂的吸附载体，制备成 了具有防治病虫害和促进植物生长的新型微生物菌剂。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供了一种与印楝渣兼容的解淀 粉芽孢杆菌HN-Il及其新型微生物菌剂的制备方法，克服了印楝渣直接使用时少量效果不 佳、大量伤苗难题，使生防菌与印楝渣有机结合，扩大防治谱。
[0011] 本发明的另一目的是提供上述高效防治香蕉枯萎病的解淀粉芽孢杆菌HN-Il及 其菌剂的应用，其对香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫具有综合防治作用。
[0012] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0013] 本发明所述解淀粉芽孢杆菌HN-Il的微生物菌剂，该菌剂以印楝渣作为生防菌 HN-Il的培养基原料及其菌剂的吸附载体，经过二次固体发酵腐熟，并添加适量的保护剂和 表面活性剂制备而成。
[0014] 本发明中所述的印楝渣作为解淀粉芽孢杆菌HN-Il的基质培养基，可以促进 HN-Il菌株产孢，也充当菌剂的吸附剂，均属于本发明的保护范围。
[0016] 上述微生物菌剂的具体制备方法步骤如下：
[0017] (1)将解淀粉芽孢杆菌HN-Il接种到营养肉汤液体培养基（牛肉膏0. 5%，蛋白胨 0.5%，恥(：10.5%，其余为蒸馏水，？册.5~7.3)，以180~300印111转速度28~351：摇瓶 培养24h，得种子液。
[0019] ⑵将步骤⑴获得的种子液按5~15 %体积比接入YPD或Landy液体培养 基，进行液体发酵生产，其发酵生产条件为：pH6. 0~7. 5,发酵温度范围为28~35°C，搅 拌速度为180~300转/分钟，通气量1 : 1，发酵时间为48~72小时，发酵液的芽孢数 > IX IOltl个/ml。培养期间进行质量和菌量检测。所述YH)培养基含有：葡萄糖12. 5g、 蛋白胨20g、酵母粉5g、牛肉膏3g，蒸馈水1L，pH自然。；Landy培养基含有：葡萄糖20g、 L-谷氨酸 5g、KH2P04lg、MgS04 · 7Η200· 5g、KC10. 5g、酵母粉 lg、L-苯丙氨酸 2mg、MnS045mg、 CuSO4 · 5Η200· 16mg、FeSO4 · 7Η200· 15mg，蒸馏水 1L，ρΗ7· 2。
[0021] (3)将步骤（2)所得发酵液（必要时浓缩至原来体积30~60% )，然后添加8% NaCl、0. 5%海藻酸钠和1%乙酸钠，混合均匀，即得HN-Il菌株的水剂。或将步骤（2)所得 发酵液按50~150ml/Kg的量接种到印楝渣固体培养基中，进行二次固体发酵腐熟，发酵过 程中每天翻堆1次，发酵温度为25~45°C，发酵3~7天，发酵结束后添加重量1 %保护剂 和5%表面活性剂，在温度不高于60°C下通风干燥，使含水量控制在25%以下，包装封袋， 即得固体菌剂。 所述的印楝渣固体培养基含有（质量比）：印楝渣〇~30 %、大豆粉4~12 %、麦麸5~ 25%、泥炭土 30~50%、KC11~5%，pH6~7. 5。特别的是，当培养基中不含有印楝渣时， 以该培养基与HN-Il制成的微生物菌剂也对香蕉枯萎病具有良好的防治效果，其田间防效 达到了 88. 7%，均属于本发明的保护范围。
[0028] 本发明所提供的微生物菌剂具体可用于防治香蕉枯萎病、番茄枯萎病、水稻纹枯 病、稻瘟病、苜蓿黄萎病、十字花科蔬菜黑斑病以及香蕉穿孔线虫，优选香蕉枯萎病和番茄 枯萎病；也可在促进植物生长中的应用。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] 本发明公布了一种微生物菌剂的制备方法，该方法以印楝渣作为解淀粉芽孢杆菌 HN-Il的培养基，同时作为菌剂的吸附载体，经过二次发酵腐熟制备成菌剂。利用解淀粉芽 孢杆菌加快印楝渣腐熟进程，同时保证生防菌大量生长繁殖，既克服了印楝渣直接使用时 少量效果不佳、大量伤苗难题，又使生防菌与印楝渣有机结合，扩大防治谱。此外，具有节约 资源、变废为宝和促进农业副产品的循环利用等优点，并且制备工艺简单，效果好，成本低， 这也是本发明的特点之一。
[0031] 经过实验证实，本发明的解淀粉芽孢杆菌HN-Il及其菌剂对香蕉枯萎病和香蕉穿 孔线虫具有良好的防治效果，对香蕉枯萎病田间防效达到96. 2%以上。由此可见，该菌剂在 防治香蕉枯萎病和香蕉穿孔线虫等植物病虫害方面具有巨大的应用前景，可以进行规模化 推广应用，具有广阔的市场前景，将带来巨大的经济效益和生态效益。
[0032] 本发明所采用的芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) HN-11，筛选自广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园中印楝树的根际土壤，经实验证 明，该菌株与印楝渣具有良好兼容性，能以印楝渣为唯一碳源的培养基生长，并且能高效抑 制香蕉枯萎病菌、番茄枯萎病菌等植物病原菌的生长，这为维管束病害提供了一种新的防 治措施。该菌株已于2013年10月31日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保 藏号为CGMCCN0 :8421，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0033] 该菌株主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，产芽孢，厌氧条件不能 生长，接触酶阳性、氧化酶阳性、VP反应阳性，VP〈pH6、VP>pH7均呈阴性，甲基红试验阴性， 氧化葡糖糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、乳糖、甘露醇产酸，可利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性， 淀粉水解阳性，精氨酸双水解阴性，分解酪蛋白阳性，在50°C、pH5. 7、7% NaCl条件下生长。
[0034] 经过序列测定，该菌株HN-Il的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0035] 菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
[0036] 拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens
[0037] 菌株编号：HN-11
[0038] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0039] 保藏机构简称：CGMCC
[0040] 保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0041] 保藏中心登记入册编号：CGMCC NO :8421
【附图说明】
[0042] 图1为解淀粉芽孢杆菌HN-Il对香蕉枯萎病菌4号小种的拮抗作用。
【具体实施方式】
[0046] 实施例1解淀粉芽孢杆菌HN-Il的富集筛选和鉴定
[0047] 1、解淀粉芽孢杆菌HN-Il的富集筛选
[0048]以采自广东省广州市华南农业大学杀虫植物标本园中印楝树的根际土壤为土样。 称取IOg 土壤加入印楝渣培养基（印楝渣30g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，pH自然）28°C富集 培养一周，然后称取IOg 土壤培养物放入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡后静置 lOmin。取ImL上清液按10倍梯度浓度稀释至10-4、ΚΓ5、KT6浓度，分别取0.1 mL稀释液， 涂布于LB培养基（蛋白胨10g，酵母粉5g，NaC110g，琼脂粉15g，蒸馏水lL，pH自然）平板 上，28°C倒置培养2~3d，根据菌落形态、颜色等特征挑取不同的单菌落进一步利用平板划 线法纯化。
[0049] 平板对峙培养法：以香蕉枯萎病菌4号小种等病原菌为指示菌，在PDA平板中央接 入直径为5mm的病原菌菌饼后，在距菌饼2. 5cm处接种纯化后的菌株，28°C继续培养，连续 观察记录各菌株抑菌带。 含毒介质法：将在平板对峙培养法中筛选出的具有较好活性的菌株接入营养肉汤液体 培养基（牛肉膏〇. 5%，蛋白胨0. 5%，NaC10. 5%，琼脂1. 5%，其余为蒸馏水，pH7. 2)，摇床 培养24h后待用。在培养皿（直径90mm)中加入ImL菌液，再加入19mL冷却至45°C左右的 PDA培养基，混匀，待培养基凝固后，在PDA平板中央接入直径为5_的病原菌菌饼，重复三 次，以不含菌液的平板为对照，28°C培养待对照中病原菌长满平板后测定菌落直径，根据以 下公式计算HN-Il菌株对各病原菌的抑菌率。 抑菌率计算公式：抑菌率（％) =[(对照菌落直径-处理菌落直径V(对照菌落直 径-5)]X100 实验结果最终筛选获得一株对香