一种铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞领域，尤其涉及一种铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法及其用 途。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞，被称为"万用细胞"。衰老是一个复杂的生物学过程，除受基因的调控、疾病、不 良生活习惯及社会心理负荷的影响外，还受环境因素的影响。目前，对皮肤不良作用的环境 因素主要有日光中的紫外线和红外线、香烟烟雾和空气污染等，其中紫外线的影响尤为显 著，可以加速生理衰老的过程。近年来，瑞士科学家发现了一种苹果干细胞具有激活休眠细 胞、修复受损细胞和促进细胞再生的功能，从而达到延缓皮肤衰老的效果，为植物干细胞在 延缓衰老的研宄领域中奠定了基础。
[0003] 铁皮石斛是兰科石斛属植物，为兰科多年生附生草本植物。铁皮石斛干细胞含有 较多的超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化物酶（POD)和过氧化氢酶（CAT)等高活性酶；因此， 铁皮石斛干细胞具有较强的抗氧化的作用，是一种纯天然、环保、无污染的抗衰老植物干细 胞。
[0004] 然而，由于植物细胞培养技术在培养期间无法维持稳定的，较快的细胞增殖与高 的代谢产物的问题，限制了铁皮石斛抗衰老植物干细胞的应用。为了解决该问题，中国专利 申请201410486185. 1公开了一种铁皮石斛干细胞及其分离培养方法，该方法是从铁皮石 斛根尖静止中心的细胞系开始培养，获得稳定遗传的植物干细胞进行培养，该培养方法解 决了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，由于其干细胞系的细胞尚未分化，具有细胞活性强 的优点；但是，静止中心的干细胞具有较长的细胞周期，细胞培养需要较长的时间，不能维 持稳定的，较快的细胞增殖，无法满足植物细胞培养技术的产业化生产。因此，研宄一种细 胞培养周期短，细胞增殖速度快的铁皮石斛细胞培养技术推动植物干细胞的应用是亟需解 决的难题。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术铁皮石斛植物细胞培养技术细胞培养周期长，细胞增殖速度慢 的缺陷，本发明的目的是提供一种铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法及其用途，以解决以 上缺陷。
[0006] 本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤： 51. 取切除根冠的铁皮石斛根尖，清洗，消毒； 52. 将步骤Sl得到的铁皮石斛根尖切成大小，接种至含有硫酸锌、柠檬酸、 甘氨酸、α-萘乙酸、蔗糖、活性炭和琼脂的固体培养基上，培养温度为25_29°C，pH值为 6-6. 5,培养20-30天，得形成层来源的铁皮石斛干细胞； 53. 将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至含有硫酸锌、柠檬酸、甘氨酸、α-萘乙酸、 蔗糖、麦饭石颗粒和硒矿石颗粒的液态培养基中培养； 54. 将步骤S3培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入气升式生物反应器内培 养，培养液使用步骤S3的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反 应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水； 55. 将步骤S4的气升式生物反应器内的培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养 物取出，放入-75~-85°C超低温冷冻2-3h，取出解冻30-40min，重复3-5次；最后一次解冻 后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，得到铁皮石斛干细胞 提取物； 56. 往步骤S5中的铁皮石斛干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0. 5Pg/ml， 加入铁皮石斛干细胞提取物总质量的4-6%的甘露醇，灭菌，在温度为-20~-35°C，真空度 为50~200Pa中冻干，制得铁皮石斛干细胞冻干粉。
[0007] 其中，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S2中固体培 养基成的分含量为硫酸锌2-3 mg/L、柠檬酸77-83mg/L、甘氨酸79-84mg/L、α -萘乙酸 2-2. 8 mg/L、蔗糖 10. 5-11. 5mg/L、活性炭 460-540mg/L 和琼脂 2. 8-3. 5mg/L。
[0008] 进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述的步骤S3中液 体培养基成分的含量为硫酸镁181_183mg/L、柠檬酸77-82 mg/L、甘氨酸76-84mg/L、α -萘 乙酸3.3-4. 5mg/L、鹿糖32-34 mg/L、麦饭石颗粒65-75 mg/L和硒矿石颗粒65-75 mg/L。
[0009] 进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S4中 蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水混合液是气升式生物反应器内培养液的体积比为 0.8-1:1〇
[0010] 更进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S5中过 滤器的滤芯孔径是1-3 μ m。
[0011] 本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法在培养过程中无细胞变异，分离 培养的铁皮石斛干细胞纯度高，可以达到95%以上，有利于该铁皮石斛干细胞冻干粉的制 备方法的推广和应用。
[0012] 另外，本发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉在制备抗衰老护肤品中的用途。
[0013] 其中，所述的抗衰老护肤品可以制成精华素、乳液、爽肤水、面霜、眼霜和面膜；本 发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉制备的抗衰老护肤品优选制成眼霜。
[0014] 本发明提供的一种抗衰老眼霜，所述眼霜包括以下组分： A 相：丙二醇 l_4g、丙三醇 2-6g、丁二醇 l-5g、卡波 0· 1-0. 6g 和水 50-70g ; B相：二甲基硅氧烷0. 5-2g、辛酸癸酸三甘油酯l-4g、棕榈酸异丙酯l-4g、合成角鲨烷 l-3g、鲸赌硬醋醇醚2-6g ; C相：如权利要求1所述的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法制得的铁皮石斛干细胞 冻干粉8-15ng、聚合杏仁蛋白l-3g、富醚斯金0. 5-2g、防腐剂0. 1-0. 5g和水10-20g ; D相：三乙醇胺0.2-0. 4g。
[0015] 优选地，本发明提供的抗衰老眼霜包括以下组分： A相：丙二醇2g、丙三醇4g、丁二醇3g、卡波0. 35g和水60g ; B相：二甲基硅氧烷lg、辛酸癸酸三甘油酯3g、棕榈酸异丙酯3g、合成角鲨烷2g、鲸蜡 硬醋醇醚3. 5g ; C相：如权利要求1所述的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法制得的铁皮石斛干细胞 冻干粉long、聚合杏仁蛋白2g、富醚斯金lg、防腐剂0. 2g和水IOg ; D相：三乙醇胺0· 35g。
[0016] 进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的卡波为卡波940。
[0017] 进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的鲸蜡硬酯醇醚由鲸蜡硬酯醇醚_2和 鲸蜡硬酯醇醚-21按质量比为1-2. 5:1-3混合组成。其中鲸蜡硬酯醇醚-2和鲸蜡硬酯醇 醚-21购于巴斯夫股份公司（BASF SE)，鲸蜡硬酯醇醚-2的型号是BRIJ721，鲸蜡硬酯醇 醚-21的型号是BRIJ721。
[0018] 进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的防腐剂为Euxyl K100。其中Euxyl KlOO购于德国舒美有限公司，Euxyl KlOO的成分为苯甲醇、甲基氯异噻挫啉酮、甲基异噻挫 啉酮；该Euxyl KlOO防腐剂对细菌，酵母菌和霉菌具有广谱均衡的抑制功效，可以有效延 长产品的保质期。
[0019] 另外，本发明还提供了一种抗衰老眼霜的制备方法，包括以下步骤： 将A相组分和B相组分分别加入锅中，加热至70-80°C，搅拌至完全溶解，并将A相加入 B相中混合，放入均质机中均质3~5min，冷却至50-30°C ;将C相组分混合搅拌至完全溶解； 将C相和D相加入A相和B相的混合液中，均质即得。
[0020] 相对于现有技术，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，具有以下优 占. (1) 本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法具有细胞培养周期短，细胞增殖 速度快的优点； (2) 本发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉具有激活休眠细胞、修复受损细胞和促进细 胞再生的作用，对人体皮肤具有抗老化及延长细胞寿命的效果； (3) 本发明制得的抗衰老眼霜对眼部的鱼尾纹、眼袋、皮肤松弛具有显著的改善作用。
【具体实施方式】
[0021] 以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发 明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替 换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
[0022] 实施例1、铁皮石斛干细胞冻干粉的制备 51. 取切除根冠的铁皮石斛根尖，用水清洗2h后用浓度为70%酒精表面消毒10s，无菌 水冲洗3次；再用浓度0. 1%升贡溶液消毒lOmin，无菌水冲洗3次，备用； 52. 将步骤Sl消毒后的铁皮石斛根尖切成大小，每瓶1±夬，接种至含有2mg/