九种人肝cyp450酶体外抑制效应快速筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人肝CYP450酶体外抑制效应快速筛选的方法，具体涉及采用特异性 探针底物表征酶活性，利用体外混合探针底物法（N-in-one)与LC-MS/MS联用同时测定多 种特异性代谢产物，进而判别九种人肝CYP450酶活性变化，并以此作为体外代谢酶抑制效 应的评判依据。
【背景技术】
[0002] 长期以来，在药物安全性评价中细胞色素 P450s酶系（CYP450)在药物代谢和药物 代谢性抑制相互作用中占据了重要地位。在新药研发的早期阶段利用体外实验数据尽早预 测新化学实体（NCEs)在体内潜在的药物相互作用，获取相关代谢信息，可以有效地提高新 药筛选的成功率，减少开发成本。
[0003] 体外混合探针底物法（N-in-one)与LC-MS/MS方法联用在新药研发早期快速评价 NCEs对CYP450抑制相互作用中得到了广泛应用。混合探针底物法，也称Cocktail探针底 物法，即一次实验给予两种或两种以上经不同酶代谢的底物，同时得到多个酶活性信息，加 之高灵敏、高选择性的LC/MS/MS技术，实现了对多种探药代谢物的同时检测，即同时监测 多个CYP450亚型酶活变化，从而提高筛选通量，提高效率，降低成本。在新药开发早期阶段 使用N-in-one技术一直存在争议，原因在于采用此法需要考虑多种因素的影响，包括探针 底物选择、避免底物间相互作用、孵育体系辅因子优化等等。而目前报道的方法仍存在不同 程度的缺陷，如忽略底物之间的相互作用，将不同亚型的底物置于同一体系中孵育，从而导 致假阴性结果的发生。
[0004] 混合探针底物法一般选取一种特异性探针底物表征酶活性，但CYP3A4 (ArCh BiochemBiophys，2001，391(l) :49-55)和 CYP2C9(Nature，2003,424(6947) :464-468)等 亚型因存在多个结合位点，故有必要选择多个结构不相关的底物表征酶活性。近年来不断 有CYPs同工酶被发现具有抑制效应的底物依赖性，如CYP2C8 (Drug Metab Dispos，2011， 39(9) :1546-1554)、CYP2C9 (Drug Metab Dispos，2009,37(l) :59-65)、CYP2C19 (Drug Metab Dispos，2008,36(3) :523-528)、CYP2D6 (Drug Metab Dispos，2012,40 (I) :47-53) 等。因此，在药物抑制相互作用的体外评价中，尤其是CYP2与CYP3,尽可能选择两种或者 两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性，以提高体外结果的可靠性以及体内预测 的准确性。
[0005] 同一孵育体系中的不同底物之间可能存在药物相互作用，如CYP2B6探针底物安 非他酮对CYP2C19介导的美芬妥英羟化代谢、CYP2D6介导的右美沙芬-0-脱甲基代谢有抑 制作用（Drug Metab Dispos，2000,28(10) :1176-1183)，CYP1A2 探针底物非那西丁在高浓 度下可抑制CYP2C9介导的甲苯磺丁脲羟化代谢（Drug Metab Lett，2011，5(l) :17-24)。提 示在进行体外混合探针底物共温孵时须避免同时应用此类存在相互作用的底物，或降低底 物浓度或采取分组策略。
[0006] 近年来，"BSA(牛血清白蛋白）效应"在校正体外酶动力学参数方面的报道越来越 多，成为体外-体内相关性预测的热门话题，用BSA矫正后的体外表观IUt进行体外-体 内相关性分析所得到的体内肝清除率更接近于药物实测值（2~5倍）。Rowland等（J Pharmacol Exp Ther，2007,321 (l) :137-147)研宄发现生物膜在体外37°C孵育过程中会释 放出一些抑制CYPs活性的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸、花生四烯酸等），而BSA的 加入可以封闭这些不饱和脂肪酸在孵育过程中自生物膜的脱落，逆转抬高了的心值，俗称 "BSA效应"。这种"BSA效应"还存在底物选择性和酶选择性。而目前尚无在混合探针底物 体系中纳入BSA作为辅因子的报道。另外，多种有机溶剂及缓冲液对酶活性的影响亦不同。
【发明内容】
[0007] 本发明需要解决的技术问题是：选用多种不同探针底物表征代谢酶活性，并综合 考虑缓冲液、有机溶剂、辅因子对酶活性的影响及底物相互作用等因素，优化混合探针底物 孵育体系，以用于新药研发早期的代谢酶抑制效应快速筛选。
[0008] 为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，包括：
[0009] 底物选择：依据各亚型酶特性选择一种或多种探针底物表征酶活性。
[0010] 缓冲液考察：分别考察在TriS-HCl缓冲体系和PBS缓冲体系中CYP450各亚型酶 活性。
[0011] 溶剂效应考察：考察孵育体系中有机溶剂（甲醇、乙腈）的比例为〇. 5%和1 %时， 对各亚型酶活性的影响。
[0012] BSA效应考察：分别考察加入不同浓度BSA(0. 5%，1%，2% )与不加 BSA相比，各 亚型酶的活性变化。
[0013] 底物相互作用考察：据报道，CYP2B6探针底物安非他酮抑制CYP2C19介导的美芬 妥英羟化代谢和CYP2D6介导的右美沙芬去甲基化代谢。由于安非他酮Km值（67-168 μ M) 较高，故考察安非他酮（〇,5，10μΜ)对CYP2C19的另一底物奥美拉唑、CYP2D6的另一底物 丁呋洛尔是否存在抑制作用。
[0014] 样品孵育、处理及测定：将不同亚型特异性探针底物根据上述溶剂效应、缓冲液、 BSA效应以及底物相互作用等进行分组孵育20min后，冰浴终止反应并加入含内标的沉淀 剂，离心后取各组上清等体积混匀后LC-MS/MS测定。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明所建立的方法综合考虑了底物的选择、底物之间的相互作用、缓冲液、有 机溶剂以及一些温孵系统辅因子对酶活性的影响等，希望降低体外混合探针底物法预测 药物相互作用的假阴性发生率，提高预测结果的准确性；且能同时筛选化合物对九种主要 CYP450亚型的抑制效应，提高了筛选通量。
【附图说明】
[0017] 图I !Tris-HCl缓冲体系和PBS缓冲体系中酶反应活性比较
[0018] 图2 :有机溶剂甲醇、乙腈对主要CYP450酶活性的影响
[0019] 图3 :BSA对不同底物表征的代谢酶反应速率影响
[0020] 图4 :安非他酮对丁呋洛尔和奥美拉唑表征的代谢酶反应速率影响
【具体实施方式】
[0021] 本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。
[0022] 1底物选择
[0023] 如前所述，混合探针底物法通常选取一种特异性探针底物表征酶活性，但对于 CYP3A4和CYP2C9等存在多个结合位点的亚型而言，应选择多个结构不相关的底物表征酶 活性。除多结合位点现象外，CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等亚型还存在抑制效应的 底物依赖性。因此，本发明所建立的筛选方法中，尤其对于CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6与 CYP3A4,选择两种或者两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性（详见表1)，以提 高体外结果的可靠性以及体内预测的准确性。
[0024] 表1九种主要CYP450酶亚型及其所选特异性探针底物
[0025]
[0026] 2体外孵育体系优化
[0027] 2. 1实验材料
[0028] 人肝微粒体（HLM)购自瑞德肝脏疾病研宄（上海）有限公司，微粒体蛋白浓度 为 10mg/500 μ 1。Na2HPO4 · 12H20、NaH2PO4 · 2H20、KCl、MgCl2 · 6H20 购自南京化学试剂 有限公司，Tris-base购自Biosharp公司；烟酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸（NADP+)、6_磷 酸葡萄糖（G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH)、牛血清白蛋白（BSA)、邻甲苯海拉 明（mephenamine)购自Sigma公司。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）购自Merck公 司。特异性探针底物非那西丁（phenacetin)、香豆素（coumarin)、紫杉醇（paclitaxel)、 甲苯横丁脈（tolbutamide)、美芬安英（S-Mephenytoin)、奥美拉挫（omeprazole)、 丁 呋洛尔（bufuralol)、氯挫沙宗（chlorzoxazone)、尼非地平（ni6edipine)购自 Sigma-Aldrich (St. Louis，M0，USA);安非他酮（bupropion)购自 Toronto Research Chemicals (Toronto，Canada);双氯芬酸（diclofenac)、右美沙芬（dextromethorphan) 购自 damas_beta(Adamas Reagent Co. Ltd);睾酮（testosterone)购自 International Laboratory USA;咪达挫仑（midazolam)购自中国药品生物制品检定所。
[0029] 磷酸盐缓冲液（PBS) :0.1 M KCl-磷酸盐缓冲液：含 0.1 M KC1、0.1 M Na2HP04、0.1 M NaH2PCM ;pH = 7. 4。
[0030] Tris-HCl 缓冲液：含 Tris-base 0· 1M，pH = 7· 5〇<