一种用于焦磷酸测序中emPCR的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于焦磷酸测序中emPCR的方法。【
背景技术：
】[0002]焦磷酸测序技术新型的DNA测序技术，焦磷酸测序法操作极为简便，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性高，同时速度相较于Sanger测序法有了很大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研宄和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。[0003]该技术可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。原理焦磷酸测序技术是由几种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。[0004]焦磷酸测序中所使用的模板需要通过emPCR(emulsionPCR)的方法制备得到。emPCR主要通过将水相PCR溶液(包含有引物，聚合酶，核苷酸和待扩增DNA)与油混合，创建一种微小的悬浮水滴乳液。每个液滴都作为其自身PCR的"反应器"，从而创造了平行反应中的多个独立反应。目前市面上的很多数字PCR仪器能进行这种实验，其优点之一在于这样大量的独立反应能令产物只见到交叉污染缩小到最少，并且更重要的是，乳化PCR方法能将单调乏味的实验进化成高通量的扩大实验。现在需要一种能够提高检测速度和精度的emPCR方法以克服现有的技术缺陷。【
发明内容】[0005]本发明的一个目的是一种用于焦磷酸测序中emPCR的方法，包括以下步骤：(1)DNA文库的获得；(2)乳液PCR;(3)DNA文库微球的富集回收；所述DNA文库微球的富集回收使用盐溶液。[0006]所述乳液PCR的反应体系中包括水相、油相、表面活性剂与助表面活性剂。[0007]所述水相中含有emPCR助剂；还含有Buffer、引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和水。[0008]所述水相中还包括焦磷酸酶，焦磷酸酶为热稳定焦磷酸酶（thermostablepyrophosphatase)〇[0009]所述emPCR助剂包括betaine(甜菜碱)、D-(+)trehalose(右旋海藻糖)、L-camitine(左旋肉碱)、NP-40(乙基苯基聚乙二醇）、DTT(二硫苏糖醇）和DMSO(二甲基亚讽）中的一种或几种，优选为betaine、D-(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT和DMSO。[0010]占体系的浓度或体积比为Betaine0.4-1.0M，D-(+)trehalose0.2-0.5M，L-carnitine0·1-0.4M，NP-400·2-0.6%，DTT1-2.5mM，DMSO1-2.5%，优选为Betaine0·45-0.90M，D-(+)trehalose0·2-0.4M，L-carnitine0·15-0.35M，NP-400·3-0.5%，DTT1-2.3mM，DMSO1-2.3%(其中的百分含量为体积比)。[0011]所述油相为DC5225C、PGFE、DC749和矿物油中的1种或几种，优选为PGFE和DC749。[0012]所述表面活性剂为span80、TritonX-100、tween80、tween60和tween20中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-100溶于水相。[0013]所述表面活性剂占体系的体积比为span802.5-5%，TritonX-1000·4-1.0%，tween800·2_0·5%，tween600·3_0·5%、tween200·2_0·8%;优选为span802·5_3·5%，TritonX-1000.7-0·9%，tween800.3-0·4%，tween600.4-0·5%和tween200.4-0·7%〇[0014]所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。[0015]所述水相与油相的体积比为4:9-4:7。[0016]所述体系中还包括保护剂。保护剂为BSA(牛血清蛋白）和人血清蛋白中的一种或两种，优选为BSA。[0017]所述DNA文库微球的富集回收时，微球富集准备中，退火温度为53°C-57°C。[0018]所述DNA文库微球的富集回收时，进行破乳，破乳采用二丁醇或者异丙醇。[0019]本发明的制备方法操作简单，非常有利于大规模应用。有以下优点：使用的油相、水相表面活性剂以及助表面活性剂使配制的乳液体系非常稳定，乳液扩增的效率高，错配率低，提高了乳液扩增的成功率，降低了实验成本，节省了人力物力成本。乳液体系中，液滴的单克隆比例含量高，单克隆比例的增加显著了提高了乳液扩增的效率。同时，磁性微球的富集效率高。保护剂的选择进一步改善了PCR的扩增效果。【具体实施方式】[0020]实施例1I.DNA文库的获得(1)对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。[0021]2.乳液PCR(1)配制油相，混合PGFE和DC749共400μL。[0022](2)配制水相，加入其中，emPCR助剂为Betaine0·4M，D-(+)trehalose0·5M，L-carnitine0·1M，NP-400·2%，DTT2.5mM，DMSO1%。[0023](3)按占体系的体积比，将span802.5%、tween800·4%、tween200·7%和聚乙二醇0·4%。溶于油相，TritonX-1000·4%溶于水相，混合。[0024](4)加入文库混合液，置于TissueLyser进行乳化。[0025](5)PCR扩增。[0026]3.DNA文库微球的富集回收(1)使用二丁醇破乳；(2)微球富集准备。[0027]a)微球悬液离心弃上清，加入0.125MNaOH振荡混匀，室温孵育3min。[0028]b)离心弃上清，用50〇μ1退火缓冲液离心清洗两次。[0029]c)用3〇μ1退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75μ1，振荡混匀。[0030]d)退火：55°C孵育5min后迅速置于冰上2min。[0031]e)用50〇μ1Tris-HCl缓冲液离心清洗两次，50〇μ1Tris-HCl缓冲液重悬。[0032](3)微球富集。[0033]a)取微球2〇μ1,磁力架吸附2min，弃上清。[0034]b)用50〇μ1Tris-HCl缓冲液磁力架清洗两次，使用KCl溶液清洗微球。[0035]c)使用2〇μ1Tris-HCl缓冲液重悬。振荡混匀后室温离心5min。[0036]d)置于磁力架上2min，观察。[0037]实施例2I.DNA文库的获得(1)使用CaptureBeadWashBufferTW对磁性微球祸旋震荡，重复两次，5000rpm离心，除去上清；(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。[0038]2.乳液PCR(1)配制油相，混合DC749200yL和DC5225C150yL。[0039](2)配制水相，加入其中，emPCR助剂为BetaineI.0M，D-(+)trehalose0·2M，L-carnitine0·4M，NP-400·6%，DTTImM，DMSO2·5%，(3)将span803·5%、tween800·3%、tween600·5%和丙三醇0·3%。溶于油相，TritonX-IOO(λ7%溶于水相，混合。[0040](4)加入文库混合液，置于TissueLyser进行乳化。[0041](5)PCR扩增。[0042]3.DNA文库微球的富集回收(1)使用二丁醇破乳。[0043](2)微球富集准备a)微球悬液离心弃上清，加入0.15ΜNaOH振荡混匀，室温孵育3min。[0044]b)离心弃上清，用50〇μ1退火缓冲液离心清洗两次。[0045]c)用3〇μ1退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75μ1，振荡混匀。[0046]d)退火：57°C孵育4min后迅速置于冰上2min。[0047]e)用50〇μ1Tris-HCl缓冲液离心清洗两次，50〇μ1Tris-HCl缓冲液重悬。[0048](3)微球富集a)取微球2〇μ1，磁力架吸附2min，弃上清当前第1页1 2