特异性结合人和小鼠l1cam的抗体及其用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及特异性结合人和小鼠LlCAM的新型抗体，并且更具体地，涉及以高亲和力既结合人LlCAM又结合小鼠LlCAM的抗体、编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体、导入了所述载体的转化体、包括所述抗体用于预防或治疗癌症的药物组合物、使用所述抗体用于治疗癌症的方法、包括所述抗体用于诊断癌症的组合物、包括所述组合物用于诊断癌症的试剂盒、使用所述抗体用于给癌症诊断提供信息的方法以及通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物，所述抗体通过修饰包括SEQ ID N0.1的重链可变区和SEQ ID N0.5的轻链可变区的LlCAM(LI细胞粘附分子)_特异性抗体的序列进行制备。
【背景技术】
[0002]LI细胞粘附分子(L1CAM，⑶171)是免疫球蛋白超家族细胞粘附分子(celladhes1n molecules, CAMs)之一，在细胞表面上介导细胞对细胞粘附，并且是具有200至220kDa分子量的糖蛋白。最初知道LlCAM为介导神经元与神经元粘附并涉及神经突起和神经元迀移的蛋白质(Lee 等，PNAS 74，5021，1997 ;McGuire and Greene 15，357，1978)。人LlCAM是I型整合膜糖蛋白，其由1，257个氨基酸组成并跨越细胞膜一次，并且其氨基末端部分存在于细胞膜外，其羧基末端部分存在于细胞质中。细胞外结构域含有六个2型免疫球蛋白结构域、五个纤连蛋白III样结构域和二十个N-糖基化位点。
[0003]除了在正常人脑中的最高表达之外，在一些造血细胞和肾细胞、外周神经和神经节也发现LlCAM的表达，但在其它正常细胞中没有发现(Huszar等，Human Pathology 37，1000-1008, 2006)。最近，已经报道在癌细胞(如黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和子宫内膜癌)中发现LlCAM的过表达，LlCAM在癌细胞的生长和转移中发挥重要作用，并且LlCAM的过表达与癌症的预后不良有关。由于该原因，LlCAM已经成为癌症治疗中的革巴标(Raveh 等，Cancer Letters 282:137-145，2009)。
[0004]已经有许多关于使用LlCAM抗体诊断和治疗癌症的报道。例如欧洲专利号EP1172654和美国专利号7618785公开了用于卵巢或子宫内膜肿瘤的诊断和预后的方法，其特征在于，基于LlCAM的存在指示卵巢或子宫内膜肿瘤的存在，LlCAM抗体被用于确定患者样品中LlCAM的存在和水平，以及通过向该所述患者施用所述LlCAM抗体和细胞毒药物的复合物来治疗所述肿瘤的方法。而且，美国专利公开号2004/0115206公开了通过用有效量的能够在肿瘤细胞中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的抗LlCAM的抗体接触所述肿瘤细胞用于在所述肿瘤细胞中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法。此外，国际专利公开号TO2006/013051提供了抑制在卵巢和子宫内膜癌中过表达的LlCAM蛋白及其表达的组合物，以及使用所述组合物用于预防和治疗卵巢和子宫内膜癌的方法。该专利描述了包括抗LlCAM的抗体或其衍生物的组合物抑制卵巢和子宫内膜癌并阻断癌细胞的迀移，从而实现癌症的治疗功能。而且，本发明人证实了 LlCAM表达于胆管癌，并涉及胆管癌细胞的增殖和迀移，并且胆管癌细胞的生长被抗LlCAM的单克隆抗体抑制，表明LlCAM和胆管癌之间存在相关性(韩国专利号10-756051和10-0931976)。
[0005]但是，迄今为止已经开发的LlCAM抗体为小鼠抗体，并因此存在以下缺点:所述抗体结合人L1CAM，但不结合小鼠L1CAM。通常，移植了人癌细胞的裸鼠被用于抗体的抗癌效力的动物试验。关于这一点，由于结合人LlCAM但不结合小鼠LlCAM的抗体只结合人癌症组织而不结合表达于小鼠的一些正常组织中的L1CAM，与在癌症患者中的临床试验相比，它们的抗癌效力和毒性并不能被精确评估。为了解决该问题，已经有以高结合能力既结合人LlCAM又结合小鼠LlCAM并且表现出优异抗癌效力的抗体的需求。因此，本发明人开发了具有结合人和小鼠LlCAM的能力的结合LlCAM的抗体(韩国专利公开号10-2008-0123667)。但是，仍然有必要开发以改善的结合能力既结合人LlCAM又结合小鼠LlCAM的LlCAM抗体。
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]因此，本发明人已经进行深入细致的努力以开发与小鼠和人LlCAM交叉反应并具有优异的结合LlCAM能力的抗体。其结果是，他们经突变(特别是Ab4的重链和轻链可变区的氨基酸)制备了与现有抗体相比既对人LlCAM又对小鼠LlCAM具有大大改善亲和力的抗体，并且他们发现该抗体具有优异的抗癌效力，从而完成了本发明。
[0008]技术手段
[0009]本发明的一个目的是提供特异性结合人和小鼠LlCAM蛋白的新型抗体。
[0010]本发明的另一个目的是提供用于制备所述抗体的方法。
[0011]本发明的又一个目的是提供编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体，以及导入了所述载体的转化体。
[0012]本发明的又一个目的是提供包括所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
[0013]本发明的又一个目的是提供使用所述抗体用于治疗癌症的方法。
[0014]本发明的又一个目的是提供包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物。
[0015]本发明的又一个目的是提供用于诊断癌症的方法，其包括通过使用所述抗体经抗原-抗体反应检测从被怀疑患有癌症的个体分离的生物学样品中LlCAM蛋白的步骤。
[0016]本发明的又一个目的是提供包括所述用于诊断癌症的组合物的用于诊断癌症的试剂盒。
[0017]本发明的又一个目的是提供通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物。
[0018]技术效果
[0019]本发明的抗体以高亲和力既结合人LlCAM蛋白又结合小鼠LlCAM蛋白，并因此其可以有效用于需要该抗体的领域，例如与LlCAM的过表达有关的疾病(如癌症)的诊断和治疗。
【附图说明】
[0020]图1显示了用于测量针对人和小鼠LlCAM的置换突变体的结合亲和力的间接ELISA结果，所述置换突变体通过组成结合LlCAM的Ab4抗体的CDR序列的氨基酸残基的置换进行制备，其中图1a和Ib显示了如通过间接ELISA所测量的相对于Ab4的针对人和小鼠LlCAM的置换突变体的结合亲和力，所述置换突变体分别通过组成Ab4抗体的VH CDRU2和3以及VK⑶R3的氨基酸残基置换为丙氨酸进行制备，并且图1c显示了相对于Ab4的置换突变体的抗原结合亲和力，所述置换突变体通过针对Ab4VH的位置50的缬氨酸置换为另一个氨基酸残基进行制备；
[0021]图2显示了用于分析和比较针对人和小鼠LlCAM蛋白的Ab4、Ab4M和Ab417抗体的抗原结合亲和力的竞争性ELISA的结果，其中图2a显示针对人LlCAM的Ab4、Ab4M和Ab4突变体的亲和力，并且图2b显示了针对小鼠的Ab4、Ab4M和Ab417的亲和力，其中抗体的亲和力(Kd)定义为引起所述抗体对抗原的结合能力的50%抑制所需的竞争抗原的浓度；
[0022]图3a和3b显示了用于检查Ab4M和Ab417抗体对人和小鼠LlCAM抗原的特异性的流式细胞术结果，其中人IgG用作阴性对照和结合人LlCAM但不结合小鼠LlCAM的嵌合A10-A3(cA10-A3)抗体用作阳性对照；
[0023]图4显示了检查Ab4M抗体的ADCC的结果；
[0024]图5显示了在小鼠胆管癌模型中使用Synagis抗体作为同种型阴性对照检查Ab4M抗体的抗癌作用的结果，其中图5a显示了测量肿瘤体积的结果，并且图5b显示了测量小鼠模型体重的结果；
[0025]图6a示出表明酵母表面显示的Ab4M scFv对抗原Ig5_Fc (I X ICT5至I X ICT8M)结合的FACS结果，并且图6b示出表明Ab4M scFv和Ab4M_18 scFv在酵母表面上的表达和它们对抗原Ig5_Fc的结合能力的FACS结果，其中图6b的图上的点表示一个单个酵母细胞，并且垂直轴表不表明scFv表达的Cy5焚光信号，水平轴表不表明scFv对所述抗原的结合亲和力的FITC荧光信号；
[0026]图7显示了使用Octet RED (ForteB1)系统通过SPR测量Ab4M和Ab417抗体针对人LlCAM和小鼠LlCAM的亲和力的结果，其中图7a显示了针对人LlCAM的抗体的亲和力，并且图7b显示了针对小鼠LlCAM的抗体的亲和力；
[0027]图8显示了 Ab417抗体的检测ADCC的结果；
[0028]图9显示了在裸鼠胆管癌模型中检测Ab417抗体的抗癌效力的结果，其中图9a显示了测量肿瘤体积的结果，图％显示了在21天测量肿瘤重量的结果，并且图9c显示了测量所述裸鼠模型的体重的结果；
[0029]图10显示了 Ab4M或Ab417抗体(其为本发明的结合LlCAM的抗体)的重链可变区和轻链可变区的序列，其中图1Oa显示了 Ab4M或Ab417抗体的重链可变区(SEQ IDN0.12)，图1Ob显示了 Ab417抗体的轻链可变区(SEQ ID N0.14)，图1Oc显示了 Ab4M抗体的轻链可变区(SEQ ID N0.13)，并且在图10中，根据Kabat进行编号并且⑶R加下划线；以及
[0030]图11显示了 Ab417-H6L2和Ab417_H5Ll突变体的pi值的分析结果。
【具体实施方式】
[0031]在一个方面，本发明提供特异性既结合人LlCAM又结合小鼠L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的新型抗体。
[0032]在本发明中，已经在特异性结合LlCAM的抗体中鉴定了能够改善其抗原的结合亲和力、物理性质或/和纯化效力的突变位点，所述抗体包括含有SEQ ID N0.2的重链⑶R1、SEQ ID N0.3的重链CDR2和SEQ ID N0.4的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID N0.6的轻链⑶Rl、SEQ ID N0.7的轻链⑶R2和SEQ ID N0.8的轻链⑶R3的轻链可变区，优选地，SEQ ID N0.1的重链可变区和SEQ ID N0.5的轻链可变区，从而开发了有效结合LlCAM的新抗体。
[0033]如本文所使用的术语“L1CAM(L1细胞粘附分子)”是指属于免疫球蛋白超家族细胞粘附分子(CAMs)的整合膜糖蛋白中的一个。可以从已知数据库(如位于国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank)获得关于LlCAM蛋白的信息，并且其一个例子可以为具有登录号AAI36448的LlCAM蛋白，但并不限于此。
[0034]在神经元、造血细胞、肾细胞等中发现了 LlCAM (Bateman等，EMBOJ.15:6050-6059 ；1996)并已知其涉及神经元迀移、神经突起和细胞迀移。还已知其与癌症的相关性。具体地，已经报道了 LlCAM表达于各种癌症(如黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌和结肠癌)，在癌细胞的生长和转移中发挥重要作用，并且LlCAM的过表达与癌症的预后不良有关(Raveh等，Cancer Letters 282:137-145，2009)。特异性识别LlCAM蛋白的抗体可以被用于其中LlCAM过表达的疾病(如癌症)的诊断和预防或治疗，并因此本发明人开发了以高亲和力结合人和小鼠LlCAM蛋白的抗体。由于本发明的抗体以高亲和力既结合人LlCAM蛋白又结合小鼠LlCAM蛋白，所述抗体可以被有效用于使用小鼠模型的临床研宄和其中LlCAM蛋白过表达的疾病的诊断。而且，所述抗体表现出对癌症生长显著的抑制作用，从而被有效用于癌症的预防或治疗。
[0035]如本文所使用的术语“抗体”是指蛋白分子，其包括与某种抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子(作为特异性识别所述抗原的受体)，并旨在包含多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗体和抗体片段。此外，所述抗体包含嵌合抗体(例如人源化的鼠抗体)、二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双特异抗体、三特异抗体和四特异抗体。所述术语还包括保留FcRn结合功能的单链抗体、SCAP、抗体恒定区的衍生物和基于蛋白质支架的人工抗体。完整抗体由两条全长轻链和两条全长重链组成，在所述轻链和重链之间具有二硫键。完整抗体包括IgA、IgD, IgE, IgM和IgG，并且IgG被进一步分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。抗体片段是指保留抗原结合功能的片段，并可以包括Fd、Fab、Fab’、F(ab’)#PFv。Fd是指重链的一部分，其包括于Fab片段中。Fab由每条重链和轻链的一个可变区、轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl结构域)组成，具有抗原结合位点。Fab’与Fab的不同之处在于其具有在重链的CHl结构域的C-末端包括一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)J^体是由Fab’的铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键所产生的。Fv(可变片段)是由每条重链和轻链的一个可变区组成的最小的抗体片段。二硫Fv(dSFv)是重链的可变区经二硫键连接轻链的可变区形成的。单链Fv(scFV)是通过肽接头共价连接重链和轻链的各自可变区形成的。可以使用蛋白酶(例如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体得到Fab或F(ab’ )2)获得这些抗体片段，并且优选地，可以通过遗传重组技术构建它们。
[0036]如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指具有一致分子组成的抗体分子，其由基本上相同的抗体群体所获得，其显示针对特定表位的结合特异性和亲和力。
[0037]典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链，每条重链和轻链包括恒定区和可变区(也称为“结构域”)。每条轻链和重链的可变区包括三个高变区(也称为互补决定区(在下文称为“CDR”))和四个框架区。CDR功能为结合抗原表位。每条链上的CDR开始于N-末端并按⑶R1、⑶R2和⑶R3连续排列。它们通过它们所定位于其上的链被区分开。
[0038]如本文所使用的术语“人抗体”是完全由人免疫球蛋白的所有成分的氨基酸序列组成的分子，其包括互补决定区和框架区。人抗体通常被用于治疗人疾病，并具有至少三个潜在优点。第一，人抗体更优选通过例如补体依赖的细胞毒反应(CDC)或抗体依赖细胞介导的细胞毒反应(ADCC)与人免疫系统相互作用以更有效地消灭革E细胞。另一个优点是人免疫系统并不将人抗体识别为外源分子。此外，甚至当人抗体以更小的剂量或更低的频率进行施用时，它们的半衰期与人循环系统中天然存在的抗体的半衰期类似。在本发明的一个实施方案中，制备的是特异性结合LlCAM蛋白的人单克隆抗体，其所有氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列组成。由于人单克隆抗体具有源自人的重链和轻链结构域，它显示低免疫原性。因此，所述抗体可以被有效用于治疗癌症。
[0039]而且，如果本发明的抗体包括恒定结构域，它可以源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。
[0040]如本文所使用的术语“组合”是指编码相同起源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽被连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定结构域组成的组的两个或多个恒定结构域形成。
[0041]如本文所使用的术语“杂合体”是指编码不同起源的两个或多个重链恒定结构域的序列存在于单链免疫球蛋白重链恒定结构域中。例如，结构域杂合体可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4组成的组的一至四个结构域组成。
[0042]如本文所使用的术语“特异性结合L1CAM(L1细胞粘附分子)的抗体”是指结合LlCAM蛋白以抑制LlCAM蛋白活性的抗体。相对于本发明的目的，所述特异性结合LlCAM的抗体是结合LlCAM的Ig5区的抗体，但并不限于此。
[0043]本发明的特异性结合LlCAM的抗体具有以高亲和力既结合人LlCAM蛋白又结合小鼠LlCAM蛋白的性质。不同于本发明的抗体，仅特异性结合人蛋白的抗体并不在移植了表达LlCAM的人癌症细胞的小鼠模型(异种移植模型)中结合在一些小鼠正常组织中而不在人癌细胞中表达的LlCAM蛋白。因此，存在以下缺点:抗癌效力不能被精确评估并且应当在灵长类动物(如猴)而不是小鼠中进行毒性测试。因此，本发明的抗体的优点在于它以高亲和力既结合人LlCAM蛋白又结合小鼠LlCAM蛋白，因此能够被用于在类似人临床试验的情况下在异种移植模型中的抗癌效力测试，并也能够被用于啮齿动物的毒性测试，导致临床前研宄中的成本节约。
[0044]为了提高对人或/和小鼠LlCAM的亲和力，特异性结合LlCAM的抗体为在这样的抗体中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基的置换的抗体，所述抗体包括含有SEQ ID N0.2的重链CDR1、SEQ ID N0.3的重链CDR2和SEQ ID N0.4的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID N0.6的轻链CDR1、SEQ ID N0.7的轻链CDR2和SEQ ID N0.8的轻链⑶R3的轻链可变区，优选地，SEQ ID N0.1的重链氨基酸序列和SEQ ID N0.5的轻链氨基酸序列。
[0045]具体地，所述抗体可以是除了包括含有SEQ ID N0.2的重链CDRl ；SEQ ID N0.3的重链 CDR2 ;和 SEQ ID N0.4 的重链 CDR3 以及 SEQ ID N0.6 的轻链 CDRl ；SEQ ID N0.7 的轻链⑶R2 ;和SEQ ID N0.8的轻链⑶R3的抗体以外的结合人LlCAM(LI细胞粘附分子)蛋白的抗体，其包括含有(i)SEQ ID N0.2的重链⑶Rl ；(ii)选自SEQ ID N0.3的重链⑶R2、具有将作为SEQ ID N0.3的重链CDR2的位置I的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸的重链CDR2(SEQ ID N0.9)和具有将SEQ ID N0.3的重链CDR2的位置5的天冬氨酸置换为谷氨酸以及将作为位置I的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸的重链CDR2 (SEQ ID N0.16);和
(iii)SEQ ID N0.4的重链CDR3或具有将作为SEQ ID N0.4的重链CDR3的位置3的一种氨基酸的组氨酸置换为丙氨酸的重链⑶R3 (SEQ ID N0.10)中的任意一个的重链可变区；以及含有(iv) SEQ ID N0.6的轻链⑶Rl或具有将SEQ ID N0.6的轻链⑶Rl的位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸的轻链CDRl (SEQ ID N0.17) ； (v) SEQ ID N0.7的轻链CDR2;和(vi)选自由SEQ ID N0.8的轻链⑶R3、具有将作为SEQ ID N0.8的轻链⑶R3的位置5的一种氨基酸的天冬氨酸置换为丙氨酸的轻链CDR3 (SEQ ID N0.1