植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码 基因与应用。
【背景技术】
[0002] 非生物胁迫如干旱、极端温度和盐碱等严重影响着植物的生长发育。其中干旱和 低温是影响世界农业生产的重要限制因素，也是制约小麦生产可持续发展的重要因素。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研宄和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研宄已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研宄相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004] 因此，利用现代分子生物技术，发掘抗逆关键基因，通过基因工程改良小麦抗逆 性，对于保障国家粮食安全具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用。
[0006] 本发明所提供的TaAREB3蛋白来源于小麦（Triticum aestivum L.)品种旱选10 号，具体可为如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 为了便于上述（a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0010] 表：标签的序列
[0011]
[0012] 上述（b)中的蚩白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0013] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0014] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0015] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基 因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0016] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；
[0018] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的 DNA分子。
[0019] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0020] 其中，序列2由933个核苷酸组成，第1-933位为0RF，编码序列表中序列1所示的 蛋白质。
[0021] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
[0022] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加 工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使 用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、 组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、泛素基因 Ubiquitin 启动子（pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境 筛选转化植株。
[0024] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为35S启动 子。
[0025] 更为具体的，所述重组表达载体为在PCAMBIA1300-GFP载体的多克隆位点处插入 所述基因后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Xba I和Spe I。
[0026] 所述pCAMBIA1300-GFP载体的构建方法如下：以pCAMBIA1300为原始载体，在其多 克隆位点插入2个CaMV 35S启动子，得到中间载体；然后在所述中间载体的Kpn I和Sac I位点间插入GFP的开放阅读框，最终得到所述pCAMBIA1300-GFP载体。
[0027] 其中，所述中间载体具体为在pCAMBIA1300载体的酶切位点Bam H I和Xba I之 间插入序列3所示DNA片段后得到的重组质粒。所述GFP的开放阅读框的序列具体为序列 表中序列4。所述pCAMBIA1300-GFP载体具体为在所述中间载体的Kpn I和Sac I位点间 插入序列4所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0028] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组 成。
[0029] 所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在 如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030] (a)调控植物耐逆性；
[0031 ] (b)选育耐逆性提尚的植物品种；
[0032] (c)调控植物对ABA的耐受性；
[0033] (d)选育对ABA的耐受性降低的植物品种。
[0034] 在（a)中，所述调控植物的耐逆性具体体现在：在所述植物体内，若所述基因的表 达量越高，则所述植物的耐逆性越强；若所述基因的表达量越低，则所述植物的耐逆性越 弱。
[0035] 在（c)中，所述调控植物对ABA的耐受性具体体现在：在所述植物体内，若所述基 因的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越弱；若所述基因的表达量越低，则所述植物 对ABA的耐受性越强。
[0036] 在（b)中，所述选育耐逆性增强的植物品种的方法，具体可包括将所述基因表达 量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0037] 在（d)中，所述选育对ABA的耐受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述基 因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0038] 本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
[0039] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下（al)和（a2)的步骤：
[0040] (al)向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因 植物；
[0041] (a2)从步骤（al)所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下（bl)和 (b2)所示性状中至少一种的转基因植物：
[0042] (bl)耐逆性提高；
[0043] (b2)对ABA的耐受性降低。
[0044] 所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述受体植物；编码所述蛋白质的 基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0045] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0046] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0047] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0048] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· I % SDS 和 I X SSC，0· I % SDS 各洗膜一次。
[0049] 所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述 转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、 电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培育成植株。
[0050] 在上述应用或方法中，所述耐逆性为如下中的至少一种：耐旱性、耐冻性。
[0051] 在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。如：小麦、烟 草或拟南芥等。
[0052] 在本发明中，所述植物为拟南芥，具体为拟南芥哥伦比亚0型（Clo-O)。
[0053] 所述蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。
[0054] 所述蛋白质在作为转录因子中的应用可体现为如下中至少一种：(al)所述蛋白 质能够在体外与ABRE顺式作用元件结合；（a2)在ABA处理下，所述蛋白质能够激活RD29A、 RD29B、C0R15A和/或C0R47基因的表达；（a3)所述蛋白质能够与RD29A、RD29B、C0R15A、 C0R47基因的启动子区结合。
[0055] 在本发明中，所述植物对ABA的耐受性具体体现为种子萌发对ABA的耐受性。
[0056] 实验证明，将可表达序列表中序列2所示DNA分子的重组表达载体转化拟南