一株戊糖片球菌p9-5及其筛选鉴定和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株微生物、筛选鉴定及应用，特别涉及一株戊糖片球菌P9-5、筛选鉴 定及在抗单核细胞增生李斯特氏菌中的应用，属于微生物的检测及应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)广泛存在于自然界中，肉 类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特氏菌的感染源，该菌在4°C 的环境中仍可生长繁殖，对环境及理化因素的适应能力非常强，耐高温、耐酸、耐低温，是冷 藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增 多。
[0003] 随着近年来世界范围内发生的多起单核细胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件以 及由此而带来的危害，使得预防和控制食品中的单增李斯特氏菌成为了人们关注的热点。 在研宄中发现，某些乳酸菌对单核细胞增生李斯特氏菌具有抑制活性。乳酸菌是一类能从 可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，是人和动物肠道正常菌群中的 优势菌，不仅具有许多有益的生理功能，而且能够产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抑菌物 质。细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或前 体多肽，产生菌对其自身分泌的细菌素具有免疫作用。在研宄中发现，某些乳酸菌细菌素对 单增李斯特氏菌具有强烈的抑制作用，因此这类细菌素引起了人们特别的关注，这些细菌 素通常都属于II a类细菌素。它经济、有效、并且不会对环境造成二次污染，有望从源头上 对单核细胞增生李斯特氏菌污染加以控制。
[0004] 到目前为止，国内还没有开发出成型、经济的生物制剂产品。生物制剂作为单核细 胞增生李斯特氏菌控制的一种很好的手段急需加以研宄和开发。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于针对以上不足，提供一株戊糖片球菌P9-5及其 筛选鉴定和应用，实现以下目的： 1、通过筛选抗单核细胞增生李斯特氏菌的乳酸菌菌株；抗单核细胞增生李斯特氏菌菌 株的筛选工作，建立合理、有效的单核细胞增生李斯特氏菌拮抗乳酸菌株的筛选方法。
[0006] 2、提高食品及环境中单核细胞增生李斯特氏菌污染的防控水平。
[0007] 3、为控制单核细胞增生李斯特氏菌提供更多选择。
[0008] 4、提供对单核细胞增生李斯特氏菌具有拮抗作用的戊糖片球菌P9-5。
[0009] 5、为出入境食品的单核细胞增生李斯特氏菌检验检疫提供可靠有效的检测手段。 [0010] 该菌株于2015年3月6日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号： CGMCC No. 10573,分类命名：戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus) P9-5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号 为：CGMCC No. 10573。
[0012] 基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus) P9-5,本发明提供所述戊 糖片球菌（Pediococcus pentosaceus) P9-5在抗单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。
[0013] 基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus) P9-5,所述戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus) P9-5的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤a :乳酸菌的分离纯化； 步骤b:乳酸菌的筛选； 步骤c :抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株的初筛； 步骤d :抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株的复筛。
[0014] 一种优化方案，所述步骤a包括：称取样品25g，加入225ml MRS液体培养基，37°C 培养48h，混合均匀后分别用微量移液器吸取Iml培养液用生理盐水稀释KT1-KT6六个梯 度，取10_ 4,10_5,10_6三个浓度各0.1 ml涂布MRS平板，37°C培养24h，挑取单菌落纯化。
[0015] 进一步地，所述步骤b包括：采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液 中的乳酸含量； 挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37°C培养48h后，取发酵液5mL，8000r/min 离心10min，除去菌体，加入5mL 0.0 lmol/L的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸妈，以 0. 22ΜΠ 1的滤膜过滤，取ImL滤液稀释10倍即得到待测液供上机检测； 将检测到产生乳酸的纯化后菌落进行革兰氏染色镜检和过氧化氢实验，选取革兰氏阳 性过氧化氢酶阴性菌为所需乳酸菌并保存。
[0016] 进一步地，所述步骤C包括：将单核细胞增生李斯特氏菌接种到TSA平板，30°C培 养 24h ; 挑取TSA平板上单增李斯特氏菌菌落于TSB肉汤培养基中37°C培养18小时，取ImL稀 释50倍后，取100 μ L涂布TSB平板； 将筛选出的乳酸菌株，接种于MRS肉汤培养基中37°C培养48h，每个TSB平板上放置4 个牛津杯，其中一个牛津杯加入100 μ I MRS肉汤培养基作为空白，另外三个牛津杯分别加 入100 μ 1菌液，置于30°C培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈。
[0017] 进一步地，所述步骤d包括：选出初筛过程中有抑菌活性的乳酸菌株，接入MRS肉 汤培养基培养3d后，8000r/min离心10min ; 用lmol/L NaOH溶液调整发酵液的pH到6. 5-7. 0 ; 单增李斯特氏菌在TSB培养基中37°C培养18小时，按1%接种量接种于10ml TSB液 体培养基中，加入乳酸菌发酵液，置于35°C培养，连续培养8h，每隔一定时间测定培养液OD 值，以不加乳酸菌发酵液的单增李斯特氏菌培养液为对照。
[0018] 经鉴定，测得的基因序列为： I acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact tccgttaatt gattatgacg 61 tacttgtact gattgagatt ttaacacgaa gtgagtggcg aacgggtgag taacacgtgg 121 gtaacctgcc cagaagtagg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gtataacaga 181 gaaaaccgca tggttttctt ttaaaagatg gctctgctat cacttctgga tggacccgcg 241 gcgtattagc tagttggtga ggtaaaggct caccaaggca gtgatacgta gccgacctga
[0019] 本发明采用以上技术方案，具有以下技术效果：通过采用微生物方法与化学方法 相结合的方式建立了筛选乳酸菌的新方法，通过牛津杯初筛以及复筛，从土壤中筛选出一 株具有拮抗单核细胞增生李斯特氏菌的乳酸菌。建立合理、有效的单核细胞增生李斯特氏 菌拮抗菌株的筛选方法，得到适合需要的乳酸菌株。通过乳酸菌的分离纯化以及筛选；抗单 核细胞增生李斯特氏菌菌株的初筛及复筛工作，筛选得到安全有效的单增李斯特氏菌拮抗 菌株。本发明应用于食品工业生产及环境中易被单增李斯特氏菌污染的阶段，能够提高食 品中单增李斯特氏菌防控水平，为出入境食品的单核细胞增生李斯特氏菌检验检疫提供可 靠有效的检测手段，降低进出口风险，促进进出口贸易及经济发展。
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0021] 图1为乳酸标准品2ppm色谱图； 图2为乳酸标准品与检测样品色谱叠加图； 图3为图2中检测到的乳酸色谱峰图； 图4为菌株P9-5对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌作用； 图5为菌株P9-5的Biolog鉴定结果。
【具体实施方式】
[0022] 实施例，一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)P9_5,保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 10573。
[0023] 以上戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus) P9-5的筛选方法，包括以下步骤： 1实验材料 1. 1实验菌株 样品来源 从潍坊、烟台等地区采集不同地点的土样 1. 2实验仪器 立式压力蒸汽灭菌器（日本Hirayama HVE-50);生物安全柜（XUN BSC-1300 II A/B3); 显微镜（OLYMPUS CX21);高效液相色谱仪（Aglient 1200)，分析天平(瑞士Mettler Toledo PL 602-S);恒温培养箱(德国MMM Incucell 111);移液枪(德国Eppendorf);台式高速离 心机（德国 Eppendorf 5417R); 1. 3培养基 MRS肉汤：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM187。称取52. 3g粉末加入IL水， 加热煮沸至完全溶解，分装。115°C高压灭菌15min。
[0024] MRS琼脂：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM188。称取64. 25g粉末加入 IL水，加热煮沸至完全溶解。121°C高压灭菌15min。冷却至46°C左右倒平板或斜面。
[0025] TSB培养基：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM501。称取36g粉末加入IL 水，加热煮沸至完全溶解。121°C高压灭菌15min。
[0026] TSA培养基：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM502A。称取51g粉末加入IL 水，加热煮沸至完全溶解。121°C高压灭菌15min。冷却至46°C左右倒平板或斜面。
[0027] 1. 4供试菌株： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes) 2实验方法 2. 1乳酸菌的分离纯化及筛选 称取样