一株乳酸片球菌p3-4及其筛选鉴定和在降解螺旋霉素中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株微生物、筛选鉴定及应用，特别涉及一株乳酸片球菌P3-4及其筛选鉴定和在降解螺旋霉素中的应用，属于微生物的检测及应用技术领域。
【背景技术】
[0002]乳酸菌主要分布于矿物质和有机营养物丰富的微酸环境中，奶制品、肉制品、泡菜、果酒、蔬菜等材料中都富含乳酸菌，此外，动物消化道等也是乳酸菌的重要来源。乳酸菌对动物的营养和健康有重要作用，具有抑菌消炎，抗氧化，抗肿瘤，降低胆固醇，提高免疫力等功效。
[0003]大环内酯类抗生素对革兰氏阳性菌和支原体具有突出的抗菌活性，已广泛用于畜牧业中，其在动物性食品中药物残留较为普遍，高残留会对人类造成致敏性、毒性反应，尤其是敏感个体。长期使用，会改变人类肠道菌群的微生态环境，造成人体肠道细菌菌群失调，同时易产生细菌抗药性。由于其对人体的潜在危害，包括中国在内的许多国家都已对大环内酯类药物在动物源性食品中的最高残留限量做出规定。
[0004]微生物的降解作用是食品中药物分解与转化的重要途径，利用微生物治理药物污染是一种行之有效的方法，已显示出良好的应用前景。
[0005]本研宄旨在筛选一种能降解大环内酯类兽药残留的乳酸菌株，为微生物治理复杂环境的抗生素污染提供更多选择。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于针对以上不足，提供一株乳酸片球菌(Ped1coccus acidilactici') P3-4及其在降解螺旋霉素中的应用，实现以下目的:
1、通过筛选能够降解螺旋霉素的菌株；建立合理有效的降解螺旋霉素菌株的筛选方法。
[0007]2、应用于被抗生素污染的土壤和其他环境中，提高治理抗生素污染的效率，减少二次污染，降低成本。
[0008]3、为微生物治理复杂环境的螺旋霉素污染提供更多选择。
[0009]4、提供高效降解螺旋霉素的安全、有效、经济的工程菌产品。
[0010]5、应用于被抗生素污染的土壤和其他环境中，提高治理螺旋霉素污染的效率，减少二次污染，降低成本。
[0011]该菌株于2015年3月6日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号:CGMCC N0.10574，分类命名:乳酸片球菌(/tet/1cocciAs acidilactici)。
[0012]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:一株乳酸片球菌(/bt/1cocciAsacidilac tici ) P3_4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCC N0.10574ο
[0013]基于以上所述乳酸片球菌iPed1coccus acii/i7aciici)P3-4，本发明提供一种乳酸片球菌iPed1coccus acidilactici') P3-4在降解螺旋霉素中的应用。
[0014]基于以上所述乳酸片球菌iPed1coccus acii/i7aciici)P3-4，本发明提供一种乳酸片球菌(/bt/1cocciAs acidilactici') P3-4的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤:
步骤a:乳酸菌的分离纯化；
步骤b:乳酸菌的筛选；
步骤c:降解抗生素的乳酸菌的筛选；
步骤d:乳酸菌对抗生素降解能力的检测。
[0015]一种优化方案，所述步骤a包括:称取样品25g，加入225ml MRS液体培养基，37°C培养48h，混合均匀后分别用微量移液器吸取Iml培养液用生理盐水稀释KT1-KT6六个梯度，取10_4、10_5、10_6三个浓度各0.1ml涂布MRS平板，37°C培养24h，挑取单菌落纯化。
[0016]进一步地，所述步骤b包括:采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液中的乳酸含量；
挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37 °C培养48h后，取发酵液5mL，8000r/min离心lOmin，除去菌体，加入5mL 0.01mol/L的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸妈，以
0.22Mffl的滤膜过滤，取ImL滤液稀释10倍即得到待测液供上机检测，用HPLC方法测定乳酸含量；
将检测到产生乳酸的纯化后菌落进行革兰氏染色镜检和过氧化氢实验，选取革兰氏阳性过氧化氢酶阴性菌为所需乳酸菌并保存。
[0017]进一步地，所述步骤c包括:取ImL富集培养液分别接种于含2mg/L不同抗生素的新鲜液体培养基，37 °C培养；
待抗生素选择培养基浑浊后，从中取ImL培养液接种于含3mg/L抗生素的液体培养基中，逐级类推提高抗生素浓度；
根据菌体对各抗生素耐受程度的不同，选取较高浓度的耐受生长条件进行多次驯化培养;
用接种环取最高耐受浓度培养物划线接种于含相应抗生素的固体平板上，37°C培养24-72h ；
根据平板菌落形态挑取单菌落再接种至液体抗生素选择培养基进行验证，循环三次，以获得抗生素耐受能力较好的纯菌株。
[0018]进一步地，所述步骤d包括:将筛选获得的耐抗生素单菌落分别接种于相应的适当浓度的液体抗生素选择培养基中，37°C培养l-7d ；
12000r/min离心5min，取上清稀释后用HPLC/MS/MS方法测定抗生素浓度。
[0019]经鉴定，测得的基因序列为:
I aagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccagaagca ggggataaca
61cctggaaaca gatgctaata ccgtataaca gagaaaaccg cctggttttc ttttaaaaga121 tggctctgct atcacttctg gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg181 ctcaccaagg cgatgatgcg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag241 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc301 tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc tgttgttaaa361 gaagaacgtg ggtgagagta actgttcacc cagtgacggt atttaaccag aaagccacgg421 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg481 ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtcttttaa gtctaatgtg aaagccttcg gctcaaccga541 agaagtgcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt601 agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg661 taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc721 atgccgtaaa cgatgattac taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa781 cgcattaagt aatccgcctgo
[0020]本发明采用以上技术方案，具有以下技术效果:
通过采用微生物方法与化学方法相结合的方式建立了筛选乳酸菌的新方法，通过抗生素选择培养基初筛以及复筛，从土壤中筛选出一株具有螺旋霉素降解作用的乳酸菌。建立合理、有效的螺旋霉素降解菌株的筛选方法，得到适合需要的乳酸菌株。通过乳酸菌的分离纯化以及筛选；降解螺旋霉素乳酸菌的初筛及复筛工作，筛选得到安全有效的螺旋霉素降解菌株。应用于螺旋霉素污染的治理，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低的优点。为微生物治理复杂环境的抗生素污染提供更多选择。
[0021]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0022]图1为乳酸标准品2ppm色谱图；
图2为乳酸标准品与检测样品色谱叠加图；
图3为图2中检测到的乳酸色谱峰图；
图4为菌株P3-4对螺旋霉素降解效果；
图5为菌株P3-4的B1log鉴定结果。
【具体实施方式】
[0023]实施例，一株乳酸片球菌QPed1coccus acidilactici') P3-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCC N0.10574。
[0024]以上乳酸片球菌(/bt/1cocciAs acidilactici') P3-4的筛选方法，包括以下步骤: I实验材料
1.1实验菌株样品来源
从潍坊、烟台等地区采集不同地点的土样
1.2实验仪器
立式压力蒸汽灭菌器(日本Hirayama HVE-50);生物安全柜(XUN BSC-1300 II A/B3)；显微镜(OLYMPUS CX21);高效液相色谱仪(Aglient 1260);高效液相色谱/质谱/质谱联用仪(Aglient 1260-6430);分析天平(瑞士 Mettler Toledo PL 602-S);恒温培养箱(德国MMM Incucell 111);移液枪(德国 Eppendorf);台式高速离心机(德国 Eppendorf 5417R)；
1.3培养基 MRS肉汤:购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM187。称取52.3g粉末加入IL水，加热煮沸至完全溶解。115°C高压灭菌15min。
[0025]MRS琼脂:购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM188。称取64.25g粉末加入IL水，加热煮沸至完全溶解。121°C高压灭菌15min。冷却至46°C左右倒平板或斜面。
[0026]2实验方法
2.1乳酸菌的分离纯化及筛选
称取样品25g，加入225ml MRS液体培养基，37°C培养48h，混合均匀后分别用微量移液器吸取Iml培养液用生理盐水稀释KT1-KT6六个梯度，取10_410_510_6三个浓度各0.1ml涂布MRS平板，37°C培养24h，挑取单菌落纯化。
[0027]采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液中的乳酸含量。挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37°C培养48h后，取发酵液5mL，8000r/min离心lOmin，除去菌体，加入5mL 0.0