一种淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种淋巴细胞无血清培养基及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。有先 天性的，如先天愚型、多指（趾）、先天性聋哑、血友病等，也有后天通过基因突变和染色体 病变引起的。遗传病分为三大类，其一是染色体病或染色体综合征，其二是单基因病，第三 是多基因病，目前已发现的遗传病超过3000种，估计每100个新生儿中约有3~10个患有 各种程度不同的遗传病。遗传病涉及的学科很多，包括妇产科学一不孕不育、优生优育、内 分泌紊乱；血液病学一慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、 急性淋巴细胞性白血病等；儿科学一出生缺陷；肿瘤学；内科学一放射病、染色体断裂综合 征等，具有先天性、终生性和家族性、病种多、发病率高等特点。临床常见的高血压、糖尿病、 哮喘、癌症、忧郁症、老年痴呆等与遗传有关。
[0003] 目前，对于遗传病的诊断主要采用的还是细胞遗传学的方法，即染色体核型分析。 染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色 体分带技术对某一生物的染色体进行分析，比较，排序，编号，是细胞遗传学研宄的基本方 法，是研宄物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手 段。染色体核型分析也是临床上广泛开展的对遗传病进行诊断的一种基本方法，经核型分 析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的 基因才导致的这种疾病。因此染色体核型分析在遗传病的诊断和筛查上具有重要意义。
[0004] 染色体核型分析的原理和基本过程：利用PHA (植物血凝素）刺激成熟的淋巴细胞 再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺锤丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态； 通过胰酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结 构的情况。从以上原理可以看出，染色体核型分析技术的关键是培养出合格的淋巴细胞。
[0005] 传统的淋巴细胞培养基组成：基础培养基（RP1640培养基）、抗菌素、小牛血清 (或者胎牛血清）、淋巴细胞刺激因子等组成。但是这种培养基含有小牛血清，成分复杂， 有效期短，容易出现病毒、真菌、支原体等污染，并且血清质量标准难以统一，这对大批量配 制、生产来说，很容易造成配制的质量培养基不稳定；并且胎牛血清以及小牛血清市价越来 越贵。
[0006] 为了降低成本，明确培养基成分，减少病毒、支原体等的污染，已有改良的培养基 的研宄报道，基本上就是在基础培养基的基础上添加生长因子、脂肪酸、转铁蛋白等。例如： 中国专利申请CN03147874. 3公开了用于培养淋巴细胞的无血清培养基，包含了下列组分： 基本培养基、白介素-2、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白，其中基础培养基是McCoy' s5A 改良的Eagle培养基与Ham' s-F12培养基以I : 1的比例混合而形成的培养基，Dulbecco 改良的Eagle培养基与Ham's_F12培养基以I : 1的比例混合而形成的培养基，或Iscove 改良的Dulbecco培养基，该专利通过加入脂肪酸、IL-2、胆固醇、甘油醋、转铁蛋白来代替 血清；中国专利申请201310082166公开了一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基，其必要 组成为頂DM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙 醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、柠檬酸铁、氢化可的松、乙醇胺、非 必需氨基酸，该专利通过一些激素、氨基酸、脂质、人转铁蛋白、人血清白蛋白等代替血清。
[0007] 上述各类培养基含有L-谷氨酰胺，容易降解产生胺，对细胞具有一定毒性；此外 谷氨酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，缺乏时可导致细胞生长不良甚至死亡。因此，上 述培养基在保存一段时间后对细胞培养不稳定，可重复性差。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种淋巴细胞无血清培养基及其制备 方法和应用。该培养基成分明确，能够提高淋巴细胞培养和实验的重复性，避免血清对细胞 毒性和血清源性污染，避免血清组分对实验研宄的影响，利于体外培养淋巴细胞的分化，获 得分裂相多的淋巴细胞培养基及其配方。
[0009] 为实现本发明的目的，按如下方案实施：
[0010] 本发明的淋巴细胞无血清培养基由以下成分组成：基础培养基、转铁蛋白、亚硒酸 钠、丙酮酸、乙醇胺、胰岛素、谷氨酰胺替代物、脂质型牛血清蛋白、硫酸铜、偏钒酸铵、二氯 化锰、硫酸锌、维生素 E、PHA和HEPES/NaHC03缓冲系统；所述成分的浓度分别为：所述转 铁蛋白l〇mg/L ;所述亚硒酸钠0. 01mg/L ;所述丙酮酸110mg/L ;所述乙醇胺I. 5mg/L ;所述 胰岛素 l〇mg/L ;所述谷氨酰胺替代物10mg/L-30mg/L ;所述脂质型牛血清蛋白300mg/L ;所 述硫酸铜〇· 〇〇lmg/L ;所述偏f凡酸按0· 0005mg/L ;所述二氯化猛0· 00005mg/L ;所述硫酸锌 0· 8mg/L ;所述维生素 E 2mg/L ;所述植物血球凝集素（PHA) 100mg/L ;所述4-轻乙基哌嘆乙 磺酸（HEPES)/NaHCO3 10-25mM，所述基础培养基为1640培养基。
[0011] 优选的，所述谷氨酰胺替代物为丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽的混合物。
[0012] 优选的，所述丙氨酰谷氨酰胺和所述蛋氨酸脑啡肽的浓度比例为1:1。
[0013] 优选的，所述丙氨酰谷氨酰胺的浓度为l〇mg/L，所述蛋氨酸脑啡肽的浓度为 10mg/L 〇
[0014] 优选的，淋巴细胞无血清培养基各个组分以及浓度如表1所示。
[0015] 表 1
[0016]
[0017] 本发明还提供了一种制备上述培养基的方法，按如下操作进行：取如上所述培养 基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容，过滤除菌。
[0018] 本发明还提供了上述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
[0019] 本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有硒、铜、锰、钒、锌等微量元素，通过协同作 用，能够显著增加细胞克隆和分裂相细胞数。各种微量元素使用量：亚硒酸钠0. 〇lmg/L、硫 酸铜(λ 001mg/L、偏钒酸铵(λ 0005mg/L、二氯化锰(λ 00005mg/L、硫酸锌(λ 8mg/L，对淋巴细 胞生长、增殖有较好的效果。
[0020] 本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有抗氧化剂维生素 E，能降低活性氧ROS浓 度，促进淋巴细胞的克隆和增殖。
[0021] 本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有PHA，能够刺激淋巴细胞活化，明显增加分 裂相数量。
[0022] 本发明含有丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽混合物，能刺激淋巴细胞活性明显增 高，在培养基中对淋巴细胞的生长产生巨大刺激作用，并对细胞本身无任何毒副作用，其混 合物使用量少，但是效果要比各自单独使用效果更佳。
[0023] 本发明淋巴细胞无血清培养基效果显著改进，淋巴细胞克隆数和分裂相明显增 加，提高淋巴细胞分化，充分发挥了丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽混合物、PHA的作用，可 以培养得到大量充分的处于分裂相的淋巴细胞，能够满足临床诊断和科研的要求。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :不同配方的培养基培养效果比较
[0025] 1、配制基础培养基SSF-I :配制IL基础培养基1640培养基，添加2g NaHCO3, 5g HEPES，IlOmg丙酮酸，I. 5mg乙醇胺，IOmg转铁蛋白，IOmg胰岛素，300mg脂质型牛血清蛋白， 0· IgPHA。
[0026] 2、配制SSF-2培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素 E。
[0027] 3、配制SSF-3培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0· 01mg/L亚硒酸钠。
[0028] 4、配制SSF-4培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰。
[0029] 5、配制SSF-5培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰，终浓度为0. 8mg/L硫酸锌。
[0030] 6、配制SSF-6培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰，终浓度为0. 8mg/L硫酸锌，终浓度为 0. 0005mg/L偏钒酸铵。
[0031] 7、配制SSF-7培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰，终浓度为0. 8mg/L硫酸锌，终浓度为 0. 0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0. 001mg/L硫酸铜。
[0032] 8、配制SSF-8培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰，终浓度为0. 8mg/L硫酸锌，终浓度为 0. 0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0. 001mg/L硫酸铜，终浓度为30mg/L丙氨酰谷氨酰胺。
[0033] 9、配制SSF-9培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度为 0. 01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0. 00005mg/L二氯化锰，终浓度为0. 8mg/L硫酸锌，终浓度为 0. 0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0. 001mg/L硫酸铜，终浓度为30mg/L蛋氨酸脑啡肽。
[0034] 10、配制SSF-10培养基：取1份基础培养基SSF-I，添加2mg维生素 E，添加终浓度