一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，特别涉及一种恶臭假单 胞菌海藻糖合酶经过定向改造后获得的耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，属于生物 技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖（Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经a -1，1-糖苷键连接构成 的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。 研宄表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源 和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳 定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一， 因此在科学界海藻糖有"生命之糖"的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为 海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保 护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独 特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性 保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持 食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业 以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。
[0003] 鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研 宄被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生 产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并 作为短期可见效的可行性途径之一。
[0004] 海藻糖合酶（EC5. 4. 99. 16, Trehalose synthase, TreS)是一种分子内葡糖苷转移 酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α-1，1糖苷键生成海藻糖。 该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反 应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的 应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经 超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但具有基本共 同点：一是底物转化率较低，最高只有80%左右，一般为60% -70% ;二是酶的热稳定性较 差，最适反应温度为25°C左右；三是反应时间太长，一般为48小时，有的长达72h。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，提供一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，耐高温 海藻糖合酶为通过对恶臭假单胞菌海藻糖合酶进行定向改造后获得。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种耐高温海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种耐高温海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 该耐高温海藻糖合酶在现有恶臭假单胞菌海藻糖合酶的基础上，根据模拟三维结 构，通过分子生物学手段将N端和C端蛋白质柔性区域进行截取，保留蛋白质稳定结构域 N42-C680得到。改造后的海藻糖合酶通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子 交换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。该海藻糖合酶与原始的海藻糖合酶 (KT2440)相比其表达量有所提高，热稳定性也明显提高。
[0010] 一种重组载体，在质粒中插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
[0011] 根据本发明优选的，所述质粒为pET-15b载体质粒。
[0012] -种转基因细胞系，宿主细胞内转化有上述重组载体。
[0013] 根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21DE(3)。
[0014] 上述改造后海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶 中的应用。
[0015] 上述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
[0016] 本发明所述的海藻糖合酶，由恶臭假单胞菌海藻糖合酶（Pseudomonas putida KT2440)经过分子改造获得。具体方法为：根据恶臭假单胞菌海藻糖合酶三维结构模拟，利 用PCR的方法，设计引物将其三维结构中的柔性区进行截取，获得海藻糖合酶稳定结构域 的基因。将该基因连接到pET-15b载体上构建成质粒，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进 行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析 的方法分离获得高纯度的海藻糖合酶。
[0017] 有益效果
[0018] 本发明首次将恶臭假单胞菌海藻糖合酶进行分子改造，在保留其催化活性区域的 同时截掉了其结构中的柔性区，从而获得一种新型的海藻糖合酶。经实验证实改造后海藻 合酶热稳定性比原始的海藻糖合酶在相同温度下可以提高20 %，表达量也有所提高。这为 海藻糖的工业化生产奠定了基础。
【附图说明】
[0019] 图1是恶臭假单胞菌海藻糖合酶三维结构模拟图；
[0020] 图中：N端和C端的深色区域为蛋白两端的柔性区域，其余浅色区域是该蛋白的稳 定结构域部分。
[0021] 图2是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；
[0022] 图中：M、Marker，1、原始海藻糖合酶的目的条带，2、改造后的海藻糖合酶（tres 42-680)的目的条带。
[0023] 图3是通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图。
[0024] 图4为分子改造后海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图。
[0025] 图5为分子改造后海藻糖合酶最适反应pH曲线及pH稳定性曲线图；
[0026] 其中，图5A为改造后海藻糖合酶最适反应pH曲线；图5B为改造后海藻糖合酶pH 稳定性曲线图。
[0027] 图6为海藻糖合酶改造前后最适反应温度曲线及酶活温度稳定性曲线图；
[0028]
[0029] 图7为海藻糖合酶改造前后蛋白表达量比较图；
[0030] 图中，M、Marker ;1，2为改造前细胞破碎后上清蛋白电泳图；3,4为改造后细胞破 碎后上清蛋白电泳图；箭头指示的是目的蛋白。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0032] 实施例1 :克隆得到恶臭假单胞菌海藻糖合酶（Pseudomonas putida KT2440) N42-C680片段的海藻糖合酶基因
[0033] 依据NCBI上公开的恶臭假单胞菌海藻糖合酶（Pseudomonas putida KT2440)全 长的氨基酸序列进行三维结构模拟，模拟结果如图1所示，发现该海藻糖合酶全长蛋白两 端具有明显的柔性区，即N端到第41位谷氨酸和680位异亮氨酸到C端。设计引物去除掉 着两端的柔性区，引物序列如下：
[0034] 上游引物：5' -ate gga tcc ATG GCCCAGCCCCGC-3' ；
[0035] 下游引物：5' -tea etc gag tta CCGCAGGCACAG-3' ；
[0036] 以恶臭假单胞菌海藻糖合酶（Pseudomonas putida KT2440)全长基因为模板，利 用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：
[0037]
[0038] 上述PCR反应按照如下程序进行：
[0039] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 4min，28 个循环；72°C终 延伸10min。
[0040] PCR结束后通过1%的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条 带，使用博大泰克的DNA纯化试剂盒进行回收切胶产物。
[0041] 实施例2 :将改造后海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。
[0042] PCR产物及质粒载体的双酶切反应
[0043] PCR产物的酶切体系：
[0044]
[0048] 反应条件：37 °C反应6~8h。
[0049] PCR产物和载体双酶切后的产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂 盒进行纯化回收。
[0050] 连接反应体系：
[0051]
[0052] 充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16°C连接过夜，制得连接产物。
[0053] 重组质粒的转化
[0054] (1)感受态细胞的制备
[0055] ①挑取BL21单菌落（或挑取保存菌种）接种至IOml液体LB培养基中，37 °C， 2IOrpm过夜培养；
[0056] ②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37°C，210rpm，摇70~80min至OD_达 到 0· 375 ;
[0057] ③将菌液放置于冰水混合物上lOmin，同时预冷50ml离心管；
[0058] ④将菌液转移到离心管中，4°C，3700rpm，IOmin收集菌体，弃上清；
[0059] ⑤每个离心管中加入大约IOml冰预冷的激活缓冲液（0.1 M CaCl2),用灭过菌的 5ml枪尖打散沉淀，然后再向每个管中加大约30ml冰预冷的激活缓冲液，颠倒混匀，冰上 静置20min ;
[0060] ⑥4°C，3700rpm，离心10min ;弃上清，将残液